分子生物学实验员工作总结（汇集20篇）

一. 分子生物学实验员工作总结

关于延边大学分子生物学介绍

生物化学与分子生物学是研究生命现象的化学本质及其变化规律的科学。目前已经成为生命科学领域的前沿学科，是医学、药学的一门重要的'基础课程。

生物化学与分子生物学教研室的前身是生物化学教研室，是我院历史最为悠久的教研室之一，创建于，现有硕士生导师长白山天然药物开发，已培养硕士研究生国家教育部留学归国人员资助项目各类省级课题教学论文三等奖和四等奖各1项, 吉林省高等院校科技进步杯个人奖1项，吉林省生物化学与分子生物学会青年优秀科技论文一等奖2项，吉林省科技厅鉴定成果2项；吉林省高等教育成果三等奖1项，延边大学教学成果二等奖1项。

二. 分子生物学实验员工作总结

实验一

分子生物学实验室常用仪器及使用

事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。

一、冷冻离心机

低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭）×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。

1.安装与调试

离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。2.操作程序

（1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。

（2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。

（3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。

（4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。预先设定的值。

（5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间）定的减速时间内降至零。

（6）按控制面板上的停止键，数码管显示机器已准备好下一次工作。

3.注意事项

（1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。

（2）开机前应检查转头安装是否牢固，机腔中有无异物掉入。

（3）样品应预先平衡，使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡。

（4）挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。

在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，落地式。配有角式转头：10cm在预先设定的加速时间内，其运速升，离心机开始减速，其转速在预先设dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时1

本实验6×50ml、120～30℃

至 因此低温冷冻离 以上且具有良好的通风环境再按运转键，转

（5）除工作温度、运转速度和运转时间外，不要随意更改机器的工作参数，以免影响机器性能。转速设定不得超过最高转速，以确保机器安全运转。

（6）使用中如出现0.00或其它数字，机器不运转，应关机断电，10秒钟后重新开机，待所设转速显示后，再按运转键，机器将照常运转。

（7）不得在机器运转过程中或转子未停稳的情况下打开盖门，以免发生事故。

（8）每次操作完毕应做好使用情况记录，并定期对机器各项性能进行检修。

二、电泳仪

电泳技术是分子生物学研究不可缺少的重要手段。带电泳大类，自由界面电泳不需支持物，泳目前已很少使用。区带电泳需用各种类型的物质作为支持物，纤维薄膜、非凝胶性支持物、是琼脂糖凝胶电泳。应用电泳法可以对不同物质进行定性或定量分析，组份分析或单个组份提取制备。下面以为例介绍其使用方法。

1.使用方法

（1）按电源开关，显示屏出现“欢迎使用同时系统初始化，蜂鸣

U:

0V

U＝

I:

0mA

I ＝

P:

0W

P＝

T:

00:00

T＝

其中:左侧大写Mode(模式)：STD(标准

（2）设置工作程序。用键盘输入新的工作程序。例如，要求工作电压I限制在200mA以内，功率动关掉输出。则操作步骤如下：

①按“模式”键，将工作模式由标准（凝胶性支持物及硅胶―4声，设置常设置。屏幕转成参数设置状态，见图一：

100V

50mA

｜

50W

｜ 01:00

｜U: I: P: T:)；TIME(定时W限制在 电泳一般分为自由界面电泳和区如等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电G薄层等，分子生物学实验中最常用的DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）DYY-12型电脑三恒多用电泳仪„”等字样后，Mode：

STD

中间部分显示程序的常设值)；VH（伏时）；STEP（分步）100W以内，时间T为3STD）转为定时（TIME）2

醋酸或将一定混合物进行（预置值）。U＝1000V，电流20分，并且到时间自常用的支持物有滤纸、｜

为电泳时实际值； 小时 模式。每按一下模式键，其工作方式按下列顺序改变：

STD®TIME®VH®STEP®STD。

②先设置电压U，按“选择”键，先将其反显，然后输入数字键即可设置该参数的数值。按数字1000,则电压即设置完成。

③设置电流I，按“选择”键，先使I反显，然后输入数字200。

④设置功率P，按“选择”键，先使P反显，然后输入数字100。

⑤设置时间以按“清除”键，再重新输入。

⑥确认各参数无误后，按“启动”键，启动电泳仪输出程序。在显示屏状态栏中显示Start!并蜂鸣至设置值。同时在状态栏中显示“压输出。在状态栏最下方，显示实际的工作时间（精确到秒）

⑦每次启动输出时，仪器自动将此时的设置数值存入“要调用时可以按“读取”键，再按“出执行。

⑧电泳结束，仪器显示：

2.注意事项

(1)U、I、P三个参数的有效输入范围是：

(2)一般情况下，当的地方，可以用万用表的欧姆档逐段测量。

(3)如果输出端接多个电泳槽，则仪器显示的电流数值为各槽电流之和，此时应选择稳压输出，以减小各槽的相互影响。

(4)注意保持仪器的清洁，不要遮挡仪器后方进风通道。严禁将电泳槽放在仪器顶部，避免缓冲液洒进仪器内部。

(5)本仪器输出电压较高，使用中应不避免接触输出回路及电泳槽内部，以免发生危险。

(6）长期不用仪器，应放置在干燥通风的清洁环境中保存。

三、分析天平

分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要仪器，充分了解仪器性能及熟练掌握其使用方 T，按“选择”键，先使 4声，提醒操作者电泳仪将输出高电压，“No Load！时，首先应关机检查电极导线与电泳槽之间是否有接触不良

T反显，然后输入数字Run”，并有两个不断闪烁的高压符号，表示端口已有电0”键，按“确定”键，即可将上次设置的工作程序取END”，并连续蜂鸣提醒。此时按任一键可止鸣。U：5 3

注意安全。3000V；I：320。如果输入错误，可之后逐渐将输出电压加 MO”号存储单元。以后需4～400mA P：4～400W.。～ ； 法，是获得可靠分析结果的保证。分析天平的种类很多，有普通分析天平、半自动/全自动电光分析天平及电子分析天平等。目前实验室常规备用的是自动化程度较高的电子分析天平。下面介绍电子分析天平PL203/01型和AL104/01型(METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。PL203/01型精密电子天平：最大称量210g；实际分度值0.001g；AL104/01型高分辨率电子分析天平：最大称量110g；实际分度值0.0001g

1.使用方法

（1）检查并调整天平至水平位置。检查电源电压是否匹配（使用配置的稳压器），按天平仪器要求通电预热至所需时间

（2）打开天平开关“短时点亮，天平回零时，可进行正式称量。

（3）称量时将洁净称量瓶或称量纸置于称盘上，关上侧门，天平将显示该重量，点击“®O/T¬”键自动校对零，然后逐渐加入待称物质，直至所需重量为止。

（4）称量结束应及时除去称量瓶（纸）

2.注意事项

（1）天平应放置在牢固平稳水泥台或木台上，室内要求清洁、干燥，同时应避免光线直接照射到天平上。

（2）称量时应从侧门取放物质，读数时应关闭箱门以免空气流动引起天平摆动。

（3）挥发性、腐蚀性、强酸强碱类物质应盛于带盖称量瓶内称量，防止腐蚀天平。

（4）电子分析天平若长时间不使用，则应定时通电预热，每周一次，每次预热确保仪器始终处于良好使用状态。

四、分光光度计

不同物质对不同波长入射的吸收程度各不相同，从而形成各具特征的吸收光谱原理，应用比色法可以对某些有色物质进行定性或定量分析。而且精度低，已远远不能满足高精度微量分析的要求。不断地更新换代，人们引进了分光光度法的概念，单色器、吸收池、接受器、显示屏幕所组成，它不仅适应于可见光区，同时还扩展至紫外光区及红外光区。光密度（而测定某一溶液对该单色光的吸收值。液定量和纯度的初步判断。下面介绍紫外可见光分光光度计的使用方法。该仪器除了能检测核酸样品浓度外，的测定，能检测低至几微升样品（30min。on”，天平则自动进行灵敏度及零点调节。待显示屏上所有字段，关上侧门，切断电源，并做好使用情况登记。

随着科学技术不断发展，分光光度计随之应用。OD）是许多溶液中的溶质定量的指标之一，通过所产生的单色光分子生物学实验中常使用紫外分光光度计进行核酸溶还可进行蛋白质浓度以及细胞培养液浓度70µl和5～7µl），样品无需稀释，测量后还可全部回收。4

分光光度计由光源、GeneQantTM Pro

2h，以。根据这一分析仪器也Amersham）

但由于比色法仅限于可见光区，（使用方法

(1）打开电源开关（ON），等待数秒钟，显示屏上显示一系列数据，如本机型号、当前日期等，这些数据可以重新设置，当出现“instrument Ready”即可进入下一程序。

(2）在仪器面板上有许多功能键，其中包括检测base sep、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲检测DNA，按DNA键，即进入DNA检测程序。在显示屏上：

以上为仪器预设置的参考数据，若按“新设定。

(3）取石英样品杯后放入仪器上的样品槽中，放入时注意样品杯的光学面朝前方。

(4)按“set ref”键，进行空白测试。显示屏上出现一系列数据均““Insert sample 中进行测定。

(5）一个样品测定完毕，按“

(6）取出样品杯，吸出样品，然后用高纯水洗几次，自然晾干。由于样品杯十分昂贵，使用时要小心操作。以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过

五、数字式酸度计

酸度计是实验室配置溶液必备的仪器。本实验室的酸度计为台式微电脑酸碱度计和温度计（Hanna

1.使用方法

（1）将pH

70µl或5。将样品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同样吸入待测样品，放入样品槽 ,测量pH范围为

Pathlengh

10mm

Units

µg/µl

Use 320nm

NO

Dilution Faotor 1

Insert reference，enter”键，和“select”键可以将以上的参数进行重7µl，容量大小根据需要。先用吸管吸高纯水入样品杯中，然 0.000”并提示插入样品stop”键，返回“Instrument Ready”。可用温水或稀盐酸，乙醇15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。0.00～14.00pH；温度为0.0～100.0℃；

～”不能用手指拿样品杯的光学面，用后要及时洗涤，）电极和温度探头与主机连接，主机与电源连接。

（2）取出电极保护套，如果有结晶盐出现，这是电极常见现象，浸入水后就会消逝。如果薄膜玻璃或透析膜发干，可在HI170300电极保存液中浸泡1小时。

（3）pH校准。将pH电极和温度探棒浸泡在所选的标准缓冲液内4cm（建议用pH6.86、7.01），缓冲液值可通过“D℃”或“Ñ℃”键来调节。按“CAL”键，仪器将显示“CAL”和“BUF”符号及“7.01”数据。当读数不稳定时，屏幕会显示“NOTREADY”；当读数稳定时，屏幕会显示“READY”和“CFM”，按“CFM”键确认校准值。确认第一校准点后，将pH电极与温度探棒浸泡在标准缓冲液内4cm（建议用pH4.01、9.18、10.01）；再按“CAL”键，仪器将显示“CAL”和“BUF”符号及“4.01”数据。按“CFM”键确认校正值。

（4）pH测量。校准完毕后，仪器自动进入溶液约4cm，停几分钟让电极读数稳定。

2.注意事项

（1）由于pH211酸度计内装有可充电电池，在刚购买或长时间放置后，再使用时，通电校正测量完毕后，可将电源继续还插入电源插座，只需关闭开关，这样可以保证电池充电，是校正值得以储存，下次测量时无须校正即可进入精确测量。

（2）不可用蒸馏水、去离子水和纯水浸泡电极。如果读数偏差太大（±没有校正或电极变干。为避免电极受损，在关机前要将状态时，在电极浸入电极保存液前，电极要与机器分开。

（3）如仪器已测过几种不同的样品溶液，请用自来水清洗，样品清洗电极。

（4）温度会影响pH的读数，为测量准确的补偿，用HI7669/2W温度探棒浸入样品中，紧靠电极并停几分钟，如果被测溶液的温度已知或测量是在相同温度下进行，只需动手补偿，示温度读数伴有℃信号闪烁。温度可通过“

六、PCR仪

PCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪，它是使一对寡核苷酸引物结合到正负上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列三种不同温度进行DNA变性、引物复性、PCR仪主要应用于基础研究和应用研究等许多领域，如基因分析、序列分析、进化分析、临床诊断、法医学等等。随着分子生物学的不断发展，因此了解PCR仪的性能，熟练掌握仪器的正确使用方法及使用过程中的注意事项，将是十分必要的。

现介绍PCR 扩增仪（Tl Thermocycler）的使用方法和注意事项。

pH测量状态，将电极与温度探棒浸泡在待测

pH电极从溶液中拿出。当处于关机 或在插入样品溶液前，用待测pH值，温度要在适合的范围内进行自动温度那么此时温度探棒是不用连接，Ñ℃”或“D℃”来调节。DNA片段，它的每一循环包括在DNA聚合酶催化的延伸反应的三个过程。PCR扩增技术也得到普及推广应用，6

1pH），则是由于屏幕上会显DNA链 1.使用方法

(1）接通电源开关，仪器进入准备状态；在显示屏上记录了当前仪器的温度和盖子（Lid）的温度。若仪器正在运行时，须按“

B ”键（start/stop），才能退出运行并返回准备状态。

(2）编写程序段。在准备状态下按“

C ”键(programs)进入编程状态，选定一程序号，然后按“enter”键，进入下一程序；按 “A”(list)键后，选一文件号（empty program）；再按“enter”键，进入下一程序；按“ABC”键，进入下一程序，用上下左右键号选择一个字母（A、B、C、D、„），然后按“enter”键，进入下一程序；按“name ok”键，完成文件命名。

(3）设定盖子的温度。性温度是95℃，那么盖子的温度就要设定为程序。

(4）设定变性温度、变性时间、延伸温度、延伸时间、退火温度、退火时间及循环总数等参数。从第一步依次按“间，全部参数设置完后，按“

(5）运行程序。检查设定是否正确，屏上可观察到系统运行的情况，按“

七、凝胶成像系统

本系统属全自动电脑控制影像分析系统，主要拍摄核酸的acrylamide电泳胶片。在与确定量，是分子生物学及生化蛋白试验的重要检测工具。像头，变焦镜，电脑以及专业凝胶图象采集及分析斑点测量、PCR密度的定量分析等。此外，还提供图像采集、标注、打印、数据和图像发送到Word、Excel、图像处理等功能。

1.使用方法

(1)打开电脑，启动凝胶分析软件，进入用户界面。

（2）打开采集凝胶图像的暗箱装置电源开关，放入凝胶，打开紫外光源或白光光源，将采集装置与电脑上采集卡相连，然后选择“文件”菜单中的“图像采集”或工具栏的“图像采集”按钮，出现图像窗口：晰，可以调节暗箱上的变焦镜，使之清晰。可直接将图像保存起来，也可通过“图像处理”对图像进行旋转、裁剪、滤波、调节对比度„„方面的处理。

(3)对读入的电泳凝胶图像，可以启动电泳凝胶分析系统。在“功能选择”菜单中选择“电泳凝胶”或在工具栏上的“电泳凝胶”工具，将出现泳道分析工具栏，并在“图像显示”子窗口中出现一个红色的矩形框。还可进入“条带分析”系统，对条带 lid temp：

℃”enter”键进入，用四个移位键移动设定位置。先设定温度，后设定时pgm ok”键，所设定的程序自动被保存。

按“Stop”可停止运行。markers比较后，可精确计算样本的分子量，对核酸电泳也可准 “开始采集”105℃。待盖子预热后按“start”键，选择设定好的程序，开始运行。显示 agarose本系统包括暗箱，.软件（3.3版）。该软件提供对电泳凝胶、、“停止采集”、“采集图像”等。如果图像不清 7

10℃，例如变enter”键，进入下一 紫外透射仪，摄 进行编号，对“，盖子的温度一般比变性温度要高 电泳胶片，及蛋白质的二条以上的条带进行比较。

（4）采集图像结束后，关闭暗箱电源开关，从暗箱中取出凝胶，并将玻璃板清洗干净，晾干。

八、空气恒温摇床

摇床（振荡器）为实验室的常规设备。SHK-99-Ⅱ型台式空气恒温摇床，采用微电脑控制系统，温度范围：室温＋5℃～60℃，精度±0.5℃；时间范围：1分钟～99小时59分钟；转速范围：60RPM～250RPM。

1.使用方法

(1）LED屏幕上各段数据：

000

00.0

屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段则为“转速，“Time”表示时间，不设定时可自动累计时间一直运行。的值随时可以修改，随时按新值运行。

(2）工作程序设置。按“F1”键，进入设置状态。可在速度，温度，时间，运行等四部分之间切换。在每一部分按“F2”键输入数据，输入完十位数据，再输入个位数据，按“键，再按“F2”键，到小数位，再按“

(3）再按“F1”键，转回运行状态，按“

(4）按“End”键，结束系统运行。

2.注意事项

（1）打开电源，系统开始自检，等待完毕，可以进行第2步参数设置。若屏幕出现：错误；b.“MOTOR ERROR”，表示电机部分有错误。

（2）运行过程可以打开箱盖，这样电机不运行，时间也停止，盖上盖接着运行。

（3）工作完毕，关闭电源。关机后，要等一段时间再开机。

九、水的净化装置

分子生物学实验对水的纯度要求越来越高，RPM

Temp

Time

00:00 2”，“Temp”表示温度，“RPM”表示每分钟“Temp”、“RPM”、F2”键，又到十位，以此循环。Start”键，电机开始运行，时间开始计时。LCD屏幕出现“WELCOME”字样，系统自检a.“TEMP ERROR”，表示温度检测线路有

一般蒸馏水常常难以满足实验要求，大多要求要

Time”F2”

“ 进行第二次蒸馏（双蒸水），它可以去除水中的大部分有机杂质，但制作时间较长，而且无机杂质还是很多。许多实验还需要去离子水，这就需要阴阳离子交换树脂进行处理。目前，分子生物学实验室都使用高质量的超纯水。如美国微孔滤膜公司的Milli-Q超纯水制造系统所制造的超纯水适用于许多学科领域，如分子克隆、各种色谱分析、氨基酸分析、DNA测序、酶反应、组织和细胞培养等实验。下面介绍RO-MB壁挂式反渗透高纯水机性能及使用方法。RO-MB反渗透高纯水机（杭州永洁达）产水量（25℃）10L/H；产水水质：RO纯水：<10μs/cm，高纯水：>15MΩ.cm；可用自来水制成普通实验用水和高纯水，同时满足不同水质要求。在线电导率仪对产水水质连续检测，可保证产水质量。

1.使用方法

(1)准备：先检测与纯水机相连的原水管路、废水管路连接是否正常，打开原水阀门。供电电源是否正常，检查按钮是否在关闭状态（按钮弹出状态）220V电源插座上。

(2）开机：依次按下电源开关，泵开关，纯水机启动产水，同时废水排出，指示灯亮起，并处于自动运行状态。

(3）取纯水：若打开阀门打开时，检测仪表显示高纯水电导率或电阻值。一杯水后再取新鲜水。

(4）关机：不用时可关闭个按钮停机，自来水进水阀门不必关闭，这时机子内部的进水电磁阀已自动切断水路。只要管路阀门不漏，也可使机子保持自动待机状态。

2.注意事项

（1）纯水机的正常使用环境温度为度不低于5℃。

（2）预处理滤芯一般三至六个月更换一次，实际使用寿命与自来水水质、总过滤量等有关。

（3）混床滤芯产高纯水约水中含盐量、总用水量等有关。天开机30分钟冲洗一次，冬季每隔

（4）使用过程若发现停机后泵仍频繁地每隔数分钟有规则地启动数秒钟又停机，此为管路漏水引起，需及时打开机箱加以解决。象，有利于冲洗和保护反渗透膜元件，十、消毒设备

细菌和细胞培养以及核酸等有关实验所用的试剂、RO纯水或高纯水出口阀门，则可获得相应水质的纯水。当高纯水出口 115～3吨，约二至四个月更换一次，2～3避免遭到微生物繁殖和减少污物沉积。将电源插头插入带有接地线的为了获得高质量的高纯水，可以先放掉 35℃，产水量会随温度降低而下降，冬季保养温实际使用寿命与自来水水质、2天。必须注意定期冲洗维护。夏季宜每 乃属正常现尤其高温季节。器皿及实验用具，应严格灭菌，有的实验

～设备停运时间超过天开机冲洗一次。若每隔半小时以上启动数秒钟又停机，还要求没有核酸酶的污染，故应将实验器械，试剂等进行高压消毒。对于经过导入DNA重组分子的菌株，操作后必须进行严格的高压消毒灭活处理。

大批实验物品、试剂、培养基等可以使用大型消毒器进行消毒。一些不能经受高压、高温消毒的试剂可用滤器滤膜除菌，器皿可用紫外线照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸钠（SDS）浸泡消毒。所有的细胞培养、细菌培养的操作，都应在紫外线消毒后的超净工作台中进行。

下面介绍立式自动压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI）的使用方法。

1.使用方法

（1）开盖：转动手轮，使锅盖离开密封圈。

（2）通电：连接自动进水装置。接通电源，将控制面板上电源开关按至低（LOW）红灯亮，蒸发锅内属断水状态；缺水（（3）加水：打开水源，水位达到低水位，控制面板上低水位红灯和缺水黄灯相继灭，加热（1-绿灯）亮，继续加水至高水位（（4）堆放物品：需包扎的灭菌物品，体积不超过包装之间留有间隙，堆放在金属框内，这样有利于蒸汽的穿透，提高灭菌效果。

（5）密封高压锅：推横梁入立柱内，旋转手轮，使锅盖下压，充分压紧。

（6）设定温度：通电后数显窗灯亮，上层为红色，显示温度，下层为绿色，设定温度和时间。先按控制面板上确认键，绿色数显闪烁，进入温度设定状态。按一次移位键指相应位置闪烁，根据所需数据位置进行（单项循环）移位。按△增加键或所需温度设定。设定完毕，按二次确认键，进行温度确认。

（7）设定时间：按一次确认键，将温度设定切换成时间设定；再按一次移位键，所指相应位置闪烁，完毕，按二次确认键，定时器开始倒计时。

（8）灭菌：在加热初，将下排汽阀打开至垂直位置；下排汽阀待蒸汽冒出时，压力表显示指示为的15%为宜。安全阀设定数，超出压力部分，安全阀将自动泄压，并开始计数灭菌所需时间。灭菌完成，电控装置将自动关闭加热系统，伴有蜂鸣提醒；并将保温时间切换成控制面板上电源开关按至

（9）干燥：物品灭菌后需要迅速干燥，须打开放汽阀和下排汽阀，将灭菌器内的蒸汽迅速排出，使物品上残留水蒸汽快速挥发。根据所需数据位置进行移位；进行时间设定确认。℃时，将下排汽阀推向水平关闭位置；留有微量蒸汽逸出，以控制总汽流量使用最高灭菌温度为OFF HIGH）绿灯亮，自动停止加水。按增加键或减少键，时间采用倒计时，124℃～126℃，ON处，若水位LACK）黄灯亮，电源已正常输入。

200mm×100mm×100mm为宜，各

所??减少键，进行 进行所需时间设定。设定当灭菌锅内温度达到设定温度，0.145Mpa～0.165Mpa范围内属于END显示；此时，将

100压力在处；关闭电源，停止加热待其冷却。

（10）将盖开启，取出已灭菌物品。关闭水源，打开下排水阀，排尽灭菌室的水与水垢，以备下次使用。

2.注意事项

（1）堆放灭菌物品时，严禁堵塞安全阀的出汽孔，必须留出空位保证其空气畅通，否则安全阀因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。

（2）灭菌液体时，应将液体灌装在硬制的耐热玻璃瓶中，以不超过选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞，放蒸汽，必须待压力表指针回零位方可排放余汽。

（3）对不同类型，不同灭菌物要求的物品，切勿放在一起灭菌，以免顾此失彼，造成损失。

实验二

质粒DNA

一、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，于染色体外的游离状态，制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

DNA，大小范围从

在灭菌液体结束时不准立即释 至200kb3/4体积为好，瓶口随着染色体的复特别注意，的提取－碱裂解法1kb以上不等。各种质粒都是存通常情况下可持续稳定地处但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。

二、仪器及试剂

1.仪器及耗材：37℃恒温摇床、冷冻离心机、台式离心机、微量移液器、50 ml离心管、1.5 ml离心管管、枪头、各种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。

2.试剂及配制：

LB培养液的配制：

酵母浸提物

5.0 g；

胰蛋白胨

10.0 g；

NaCl

10.0 g；

依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（约0.2 ml）调节培养液的pH值至7.0。再加去离子水将溶液定容至总体积为1000 ml，10磅高压灭菌20 min，冷却后4℃保存。

溶液 Ⅰ（GET缓冲液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖

配制：1000 ml

mol/L Tris-HCl（pH8.0）

ml

0.5 mol/L EDTA（pH8.0）ml

20% Glucose（1.11mol/L）

ml

dH2O

910ml

将以上溶液混合装瓶，10磅高压灭菌20 min，冷却后4℃保存。

溶液II（变性液）：200 mmol/L NaOH，1% SDS

配制： 500 ml

10% SDS

ml

2N NaOH

ml

取以上溶液，用灭菌去离子水定容至500 ml，充分混匀。室温保存，此溶液保存时间最好不超过一个月，最好现用现配。

注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

溶液 III(醋酸钾液)：3 mol/L 醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 5.6。5 mol/L 冰醋酸

配制：500 ml

醋酸钾

g

冰醋酸

57.5 ml

加入300 ml去离子水后搅拌溶解。待醋酸钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至高温高压灭菌后，4℃保存。

10×TE缓冲液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA

配制：1000ml mol/LTris-HCl 缓冲液(pH 8.0)

100ml

500 mmol/L EDTA(pH8.0)ml

加入约800 ml的去离子水，均匀混合。溶液定容至1 L。高温高压灭菌后，苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1)：将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入 13

500 ml。4℃保存。24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

其它试剂：TE（pH8.0）、异丙醇、氯仿/异戊醇（24:1）、无水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素贮存液（50 mg/ml）

三、操作步骤

1.菌体的培养和收获

(1）将5～10 ml含有氨卞青霉素（后接入一单菌落，并保持通气良好，于接一次，于37℃ 220 rpm振摇培养(2）吸取培养的菌液1.5 ml，转入弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

2.质粒DNA提取（碱裂解法）

（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重悬细菌沉淀，用枪吹打直至混和均匀。

（2）加200 ul溶液 Ⅱ，盖紧管口，液变透明，粘稠）。

（3）加150 ul溶液 Ⅲ，轻微振荡混和

（4）12000 rpm离心6 min，取上清液至另一离心管（弃沉淀）

（5）加等量的酚/氯仿/异戊醇，旋涡混匀离心管。

（6）加1倍异丙醇，振荡混匀，静置倒置于吸水纸，将附于管壁的残余液滴除净。

（7）加200 ul 70％乙醇洗涤沉淀物，台式离心机在室温下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）

（8）沉淀加20μl TE, 反复吹打使质粒

四、常见问题及可能原因

1.提取的质粒DNA不纯：变性不充分；关键步骤反应时间过短；离心时间或速度不够。

2.提取的质粒DNA呈涂布状：操作过程中用力过猛，动作过大；操作系统内有污染。

AP）的LB培养基加入到容量为100ml的三角瓶中，然37℃ 220 rpm振摇过夜培养（约16h）后可以再转3～4 h。的离心管中，用台式离心机以12000 rpm

轻缓上下颠倒离心管以混合内容物。室温静置10 sec，置冰上10 min(溶液出现白色沉淀。1 min，12000 r/min离心6min，取上清液至另一10 min，12000 rpm离心6 min。弃上清液，将离心管 12000 rpm离心2 min，弃上清液，将沉淀。DNA充分溶解，－20℃保存。14 min。5 min（溶)。

1.5 ml离心 3.与染色体DNA分离不全：变性过程不完全；试剂配制有问题（成分，浓度或pH）。

实验三

琼脂糖凝胶电泳

一、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，分子的迁移速度取决于分子筛效应。因而可依据DNA可以分离相对分子质量相同，而构型不同的相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。以提供一个用于确定EB)，其分子可插入下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的

一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在

二、仪器及试剂

1.仪器及耗材：

水平电泳槽、电泳仪、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。

2.试剂及配制：

50×TAE缓冲液的配制：

配制1000 ml

DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质DNA分子的双螺旋骨因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，DNA，也DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物相对可DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射DNA进行检测。0.2kb～50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝

DNA片段分离中的应用方法。

凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）15 分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的Tris

242 g

冰乙酸

57.1 ml

0.5 mol/L EDTA

ml

加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌，室温保存。

1×TAE缓冲液的配制：

称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。

溴化乙啶贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶

配制：100 ml

称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。室温保存。

6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。

配制：10 ml

溴酚蓝mg

二甲苯青FF

mg

甘油

ml

用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20℃保存。

其它试剂：DNA样品、DNA Ladder、琼脂糖、三、操作步骤

1.制备1％琼脂糖凝胶(大胶用70ml，小胶用50ml)：称取0.7 g中，加入70 ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。

2.胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取 16

0.5 g）琼脂糖置于锥形瓶3次至琼脂糖全部融化，并在固定位置放（下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

3.加样：在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。

4.电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60－100V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

(5）电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE用清水漂洗10 min。

(6)观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

四、常见问题及注意事项

1．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。

2．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。

3．电泳时应注意电源线路，预防触电。

4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。

5．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。

6．DNA带形状模糊：DNA加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。

7．质粒DNA的存在形式有3种，①共价闭环DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；③线状DNA，因质粒处断裂而造成。因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带，它们的泳动速度为：cccDNA > 线状DNA > ocDNA。min，再DNA的两条链在同一溶液染色约 DNA18

DNA

实验四

限制性内切核酸酶的酶切与鉴定

一、实验原理

限制性内切酶是一类能识别双链分子中特异核苷酸序列的水解酶，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。

限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。

5′„„GAATTC„„3′

EcoR I以独特的方式识别并裂解这个顺序，形成两个 和

……G

这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由相连接。

限制性内切酶主要用于基因组基因片段的分离与回收以及单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。大量的酶切反应。小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为

本实验为EcoR I对质粒性内切核酸酶酶切位点。琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。

二、仪器与试剂

1.仪器：

水浴锅、离心管、移液器、吸头、2.试剂：

质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。

三、操作步骤

3′„„

……CTT AA DNA的片段化、重组DNA分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同，可有pUC18的小量酶切。在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，CTT AAG„„ 5′

5′突出末端：

AATTC……

EcoR I产生的其它分子末端DNA分子的构建与鉴定、载体中目的可分为小量酶切反应和体积为20 μ50～100 μl，DNA

在质粒的双链环状DNA电泳设备等。

l, 含0.210通常可采用1 μg 30ug。6×上

G……根据酶切反应的体积不同，～用量在～分子上有多个限制

1．限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5ml PCR薄壁离心管中进行。

2.酶切反应体系（10ul）：

酶解缓冲液（10×buffer）ul

限制性内切酶

0.5 ul EcoR I(7.5U)

底物DNA（质粒）

灭菌ddH2O

限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸，混匀后离心15s。37℃水浴消化

3.酶切完毕，分子量标准物同时进行电泳以确定应，或加入适量酶后继续反应。

5.经电泳观察酶切反应完全后，将上述反应液置将剩余酶切产物保存于

四、注意事项

1.限制性内切酶需保存于

2.限制性内切酶溶液通常含有溶液底部，所以要充分摇匀。

3.加样时吸头垂直进入试剂管，避免碰到管壁，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。

4.酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深。

5.酶解消化反应温度及时间根据该酶使用说明书而定。

6.注意酶的用量，加入的酶量按的10%，以避免酶液中甘油干扰反应活性的可能，即在识别序列以外的位点进行切割。此外，反应体系中甘油的质量分数大于12%，以及缺少

五、相关问题

2h。取5ul酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，?C20℃备用。-20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。NACL和存在M

x ul（依质粒浓度而定）

加至10 ul 鉴定酶切反应效果，DNA片段的大小。如果酶切不完全，可继续65℃水浴中10～15min，中止酶切反应，50%甘油，加入反应管后，因密度较大，往往沉淀至

1-3U/ug DNA计算，酶的体积应低于反应总体积

。酶量过大（≥25U/ug DNA）时，有产生所谓星号 20

6000 r/min，DNA.酶解消化反

必须用 等情况下，都有可能出现星号活性。

1.酶的保存

不同的限制酶往往保存在大致相似的缓冲液中，这种特定配方的缓冲液能使酶活性维持较长时间。常用的保存缓冲液各组分作用如下：

Tris-HCl（7.4―7.8）：

维持稳定的pH范围。

50-100mmol/L

NaCl或KCl：提供一定的离子强度。

0.1mmol/L EDTA：

1mmol/L

DTT：

200-500ug/ml BSA：

度，防止蛋白质分子浓度过低而导致酶分子变性。

50%的甘油：

1-5 g/L的Triton-100：

白质分子的表面变性作用。

2.酶单位的定义

限制酶的单位通常定义为：1U的酶能在约完成酶切1ug的λDNA。确定限制酶单位的具体操作方法是分别向列的酶（1U左右），当电泳观察到酶切片段的条带不再发生变化时说明已作用完全，割的最少酶量定为1U的酶量。

3.限制酶的作用条件

限制酶切割DNA的反应中，酶切条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系，除了这些条件外，只有在正确选择酶反应条件时才能达到最佳酶切效果。

（1）作用温度

早期的酶切反应都在37℃进行，这种方法虽然简单、统一，但却不能达到每个酶的最适反应温度。为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度。

（2）缓冲体系

限制酶反应的缓冲体系大致相同，都含有以下组分：约作用是将酶反应体系的pH维持在7.5-8.5；约

络合掉能激活限制酶的镁离子。

保护酶分子上的还原性基团。

牛血清白蛋白提高溶液中蛋白质的浓

使酶液保存于-20℃不至冻结。

这是一种非离子型表面活性剂，能防止蛋50ul合适的反应缓冲体系中，在1ug的底物中加入一系DNA的纯度与浓度也会影响酶切效果，100mmol/L10mmol/L的MgCl2，作用是为限制酶提供激

1h内完全切Tris-HCl，的活因子；1mmol/L的DTT，作用是保护还原性基团；约150mmol/L的NaCl，作用是提供合适的离子强度。由于认识的局限性，早期的限制酶反应体系仅根据其中NaCl含量的不同分为高盐、中盐与低盐三种，这同样不能使每种酶获得最适反应条件。现在提供酶的很多厂商能提供4-10种缓冲体系，其中各必需成分之间只有很小的差别，目的是使每种酶都发挥最大的作用。

缓冲液一般配成10倍的浓度，使用时以1/10的比例加入，当然为了减小吸量误差也可自行配制5倍的缓冲液。

(3)反应体积与时间

酶反应体积一般不宜小于20ul。因为过小的反应体积在加入各种成分时易产生误差，甘油含量易超过10%。在37℃保温可因水分蒸发而明显改变反应体系中各成分的浓度，从而影响酶活力。同时还要考虑反应完毕进行电泳时，所加样品中DNA的量能够在电泳中显出清晰的泳带。

常规的酶切反应一般控制在60min内进行，但也可以根据切割对象与所用的酶将保温时间延长至十几个小时。

(4)DNA的纯度与浓度

除了上述酶反应条件外，影响酶切效果的最主要因素是DNA的纯度。例如，样品中含有大量RNA杂质时会因减少了酶的有效浓度而影响酶切效果；某些杂蛋白未除净而结合在DNA时也会影响酶切效果。至于抽提过程中未除净的各种影响因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是琼脂糖凝胶中的硫酸根离子等。

DNA纯度的另一个指标是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后电泳结果显示出不清晰条带或成为一片红色（术语称Smear）时，可肯定系统中已经污染了DNA酶。

DNA样品中含有大量RNA时可用RNA酶处理；含有结合在DNA上的杂蛋白与DNA酶时都可用氯仿/异戊醇抽提；当样品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物质时可以通过沉淀更换一个新的缓冲体系。当然，酶切失败时也不能排除除DNA外的一切因素，如无菌水，EP管，吸咀等的干净程度以及内切酶自身的酶活性情况。

除纯度外，DNA的浓度也会影响酶切效果，一般DNA质量浓度在1ug/20ul才能得到较好的酶切效果，质量浓度高达1.5ug/20ul时就可能发生酶切困难。

(5)终止酶切反应的方法

如果需对酶切片段进行连接或标记等操作时，首先要将限制酶灭活。灭活的方法可分为三种：第一种是向反应缓冲体系中加入终浓度为10-12.5mmol/L的EDTA，原理是络合掉酶反应中所需的镁离子。但这种方法会影响需镁离子的后续反应。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法来更换缓冲体系，以除去EDTA，但这样就会造成DNA的损失。第二种方法是热失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保温60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保温 22 30min方能达到目的；极端的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加热的方法使之失活。热失活方法的特点是简单并且未向体系中引入任何物质，特别适用于连续进行几个酶切反应；热失活法的另一个特点是不用更换体系，所以不会造成DNA的损失。第三种方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片段。这种方法的特点是处理条件剧烈，能使酶彻底失活（不像第一种方法中酶蛋白并未变性而只是没有激活因子而已）。

实验五

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

一、实验原理

体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。

本实验以li JM109菌株为受体细胞，受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及

二、仪器及试剂

1.仪器：

恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。

2.材料

li JM109受体菌、质粒pUC18。

3.试剂：

LB培养液（1L）：

胰蛋白胨

10g

酵母粉

5g

NaCl

10g（高盐）或

氨苄青霉素（Ampicillin）

100mg/ml

用CaCl2处理而未有转DNA测序等实验。5g（低盐）在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。待冷却至55℃，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨苄青霉素。然后贮存于4℃备用。

LB平板培养基：

胰蛋白胨

10g

酵母粉

5g

NaCl

10g

琼脂

13g

在三角瓶中依次将上述配方加入1L的重蒸水中并高压灭菌。待培养基降温至养基并轻轻旋转以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液中，根据需要加入氨苄青霉素，然后可直接从三角瓶中倒出培养基铺制平板。90mm直径的培养皿约需培养基完全凝结后，倒置平皿并贮存于4℃备用。

其它试剂：

0.1M CaCl2溶液、灭菌蒸馏水

三、操作步骤

1.感受态细菌的制备：

（1）用接种环从li JM109菌平板上挑取一单克隆菌落，培养基的试管中中，37℃ 220 rpm振荡培养过夜（12～16h）。

（2）取0.5 ml过夜菌液接种到装有50ml LB液体培养基三角瓶中中，振荡培养2－3h，隔20－30min测量OD600值，至OD600值为转至1.5ml 离心管中，每管1ml菌液，按需要决定管数。

（3）4℃，12000 rpm，离心2 min，以回收细菌。

（4）倒净上清液，倒置离心管于滤纸上1min，使残留的痕量培养液流尽。冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min。

（5）4℃，12000 rpm，2 min。

（6）倒净上清液，倒置离心管1min，使残留液流尽。每管加CaCl2重新悬浮细胞（重悬时操作要轻），即成感受态细胞悬浮液。

2.细菌转化：

（1）取3只灭菌的Ep管，分别编号1、2、3、分别加入以下各组分：加入

5g，30接种于装有0.3-0.4。无菌条件下将细菌100 ul冰预冷的 50℃，取出培50ml培养基。5ml LB液体37℃，220 rpm每管加1ml0.1 mol/L 10～20ng

或 ～ 质粒DNA（体积小于10ul），同时做两个对照组：

1号：受体菌对照组：

100ul感受态细胞悬浮液+2ul无菌ddH2O

2号：质粒DNA对照组：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19

3号：正常转化组：100ul感受态细胞悬浮液+2ul pUC19

（2）轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min，促进DNA分子在感受态细胞表面的吸附。

（3）转入便于DNA分子的吸附进入，提高转化率。

（4）迅速转入冰上冷却

（5）使受体菌恢复正常生长状态，并且表达

（6）取200ul37℃恒温培养箱倒置培养可将之置于37℃恒温培养箱继续培养，100ul左右，用移液器吹打重悬，再全部涂于含

（7）观察并记录转化子出现的数目，计算转化率。

四、注意事项：

1.实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源

2.实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。

3.必须设对照组，以检验实验过程中是否有污染。

4.整个实验过程均需置于冰上。

5.选用对数生长期细胞，42℃水浴2min，通过热刺激增强CaCL2的作用，2min，修复细胞膜。600u无抗生素lLB液体培养基，摇匀后于37℃，Ampicillin抗性基因。Ampicillin的LB平板，将平板置于无菌台直至液体被吸收，12－16h后观察结果，其余保存于4℃。如果平板上没有长出菌落，同时将剩下的500ul菌液离心，Ampicillin的LB平板上，置 DNA

OD600不应高于0.6。26

使细胞膜产生通道，220 rpm，振荡倒掉大部分上清，37℃培养。60min。留 加菌液涂在含 的污染。

实验六

动物组织细胞基因组

一、实验原理

真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，质、脂类和糖类等分离，又要保持组织细胞在含仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的

蛋白酶K在匀浆后提取EDTA则抑制细胞中分子完整地分离出来。

二、仪器及试剂

1.恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（离心管（灭菌）

SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶DNA的反应体系中，Dnase

、吸头（灭菌）DNA提取 因此，制备DNA分子的完整。提取KDNA溶液经乙醇沉淀使SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。SDS可破坏细胞膜、活性；而蛋白酶K可将 27

DNA的原则是既要将DNADNA核膜，并使组织蛋白与蛋白质降解成小肽或氨基酸，GeneQuant）DNA。真核生物DNA与蛋白 DNA分离，使DNA 的一般过程是将分散好的的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯从溶液中析出。的重要特性是能在的 仪器：、移液器、玻璃匀浆器、2.试剂：

（1）细胞裂解缓冲液：

Tris(pH8.0)

mmol/L

EDTA(pH 8.0)

500 mmol/L

NaCL

mmol/L

SDS

10%

胰RNA酶

20ug/ml

（2）蛋白酶K：

称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。

（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。

（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

三、操作步骤

1.取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K（500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5.取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，离心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm，5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

四、常见问题

1.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。

2.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少

3.提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。

4.电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。

5.分光光度分析DNA应加入SDS至终浓度为

6.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的的量或减少所取组织的量。

A280/A2600.5%，并重复步骤 DNA团块形成。1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，2～8。DNA，可加大抽提前缓冲液29

的小于

实验七

DNA的定量

一、实验原理

核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。OD260相当于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。

紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为DNA高于1.8,则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。

对于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法进行测定。DNA 本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化乙锭（EB）插入DNA 的碱基对平面之间并与之结合后，DNA样品能在紫外光的激发下产生桔红色荧光。荧光强度与被结合的EB的量成正比，而被结合的EB的量又与核酸分子长度和含量成正比，使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液的浓度。灵敏度可达1～5ng。由于是基于目测，所以是估计水平。简便，但准确性较低。

二、仪器及试剂

1.仪器：Amersham

GeneQantTM Pro 紫外可见分光光度仪，琼脂糖凝胶电泳设备。

2.试剂及配制：

5×上样缓冲液：

配制10 ml

2.0, 波长处有特异若 该方法经济

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)

ml

10% SDS

ul

50% 甘油

2.5 ml

0.2% 溴酚蓝

mg

0.2% 二甲苯青FF

mg

加去离子水至10 ml

其它试剂：0.1×TE、DNA标准液，EB储存液（10 mg/ml），三、实验步骤

1.紫外分光光度法

（1）用0.1×TE对待测DNA样品按1:20或合适的倍数稀释。

（2）开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready”时，进入核酸测定窗口

（3）调零。先用0.1×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。

（4）吸70 ul已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很少，可以用5～7ul的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260和280nm处的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA样品的浓度等。

（5）打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用高纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入下一个待测样品。

（6）DNA纯度：以OD260/ OD280比值来反映。当OD60 /OD80比值 <1.8时，说明样品存在蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿―异戊醇再抽提除去蛋白质或用乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE悬浮后再测定。当OD60/OD280比值>2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去处RNA。

2.EB荧光分析法

（1）琼脂糖凝胶的制备。

（2）样品的准备。把待测DNA样品进行1:2连续稀释，并准备一份DNA标准液作对照。

（3）上样。稀释样品与上样缓冲液按1:5混合均匀后上样。

（4）电泳。用100V稳压电泳至溴酚蓝指示剂迁移到凝胶的3/4处停止电泳。

（5）取出凝胶，入EB荧光染液中作用20min，取出后清水漂洗干净，然后紫外检测。肉眼可见到的最高稀释度约含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸样品中的严重污染干扰核酸紫外线吸收物质的情况。

四、常见问题

1． 紫外分光光度法不能区分三种构型，也不能区分染色体染色体DNA、以及偏高。

2．OD320值是背景，若溶液盐浓度越高，3．的光面以避免干扰测定。

DNADNA和DNA解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往比实际浓度 RNA等。由于测定吸收光度OD320也越高。要小心不要摔破，32

DNA分子的超螺旋、开环、线状A260时，难以排除 持杯时也不要接触透明RNA、分子的构型，如质粒测样品时使用的石英样品杯比较贵，实验八

PCR基因扩增

一、实验原理

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

PCR的工作程序实际上是一个在模板种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板裂而形成两条单链；②退火，突然降低温度后模板存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、物与模板之间；③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。

二、仪器及试剂

1.仪器：PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、2.试剂：

10X PCR 缓冲液配制（部分随Taq

250～500 mmol/L

100～500 mmol/L

15～20 mmol/L

0.5%

1mg/L

其它试剂：模板DNA、dNTP 混合液、凝胶、等

DNA扩增 DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四DNA引物按碱基配对原则互补结合，也结构简单等特点，DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个DNA链又成为下一轮循环的模板。现用图示说明PCRPCR薄壁管、电泳仪等： KCl Tris-Cl（pH8.4）

MgCl2

Tween-20

BSA Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、琼脂糖33

2n 倍。该技术已成为分子DNA主要的结合发生在引: 3 ′端开始，经过25～ 双链间的氢键断 原理酶提供）

三、操作步骤

1.PCR 体系（40ul）：

4ul

10XPCR 缓冲液

4ul

25mM MgCl2（根据不同公司PCR 缓冲液的不同而定）

Xul

模板DNA ≥50ng

1ul

上游引物（50-100ng）

1ul

下游引物（50-100ng）

1ul

dNTP Mixture（终浓度

0.4 ul

Taq聚合酶

加ddH2O至40ul

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2.将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，使反应成分集于管底。

3.PCR反应热循环程序设置：

（1）95℃

300s

变性

（2）94℃

45s

变性

（3）55℃

45s

退火（根据不同引物可能有不同退火温度）

（4）72℃

45s

延伸（每分钟可延伸

重复步骤2-4共 30 循环

（5）72℃

600s

延伸

反应结束后短暂离心，吸取少量（10ul）进行分析，其余置

4℃保存备用。

4.琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

20－200uM）1kp）6000 rpm 15 sec

离心

四、注意事项：

1.PCR 体系所加成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液浓度进行核算。

2.加样时要认真,吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。

3.Taq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深，酶量不能过多。

五、影响PCR的主要因素

1.模板DNA

单链、双链DNA白水解酶等的污染。模板用量依具体实验而定，PCR反应时模板变性要充分。

2.PCR引物

PCR引物设计是否成功是能否获得高质量应用时，需注意以下重要环节：

（1）PCR引物的长度约为以使它们在相近的温度下与其互补序列结合。随机的，应避免连续出现4个以上的单一碱基，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。引物免选用T ,尤其应避免连续出现

（2）一般来说，PCR引物长度选择24bp左右为宜。

（3）要避免引物分子自身序列互补，否则会形成发夹样二级结构。两个互之间的3，末端序列不能有明显的互补性，以免形成引物二聚体。

（4）引物的熔点温度（引物的GC/AT应与要扩增的模板

（5）引物的3，末端必须与模板严格互补，而

（6）目前在引物选择中已广泛应用计算机软件，从基因序列，并对设计的引物在引物二聚体形成、自身互补性及特异性等方面进行分析评价。PCR

18～30个核苷酸，并且成对引物间的2个以上T500bp时，引物长度选择 Tm值）要适当。DNA相当或略高些。一般熔点温度以大于DNA样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋一般为100ul反应液有105-106个目标分子。PCR产物最关键的因素之一。在设计和G＋C含量应相似。G+C含量应为45%～55%之间。碱基分布是尤其是不应在其3，端出现3个连续G或C，3，端碱基最好选用A、G、C,尽可能地避16-18bp；PCR产物≥5kb时，PCR引物相 Tm值与引物的碱基组成和长度有关；PCR55℃为宜。5，末端的要求可灵活些。EMBL或Genebank中查找有关

均可作为的模板。产物≤

（7）用于亚克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性内切酶位点。为了保证内切酶有效酶切扩增产物，一般在酶切位点的5，端再加上几个额外的碱基。

（8）引物的浓度，在终浓度为0.2～1.0 umol/L的范围内产量基本相同，低于0.2 umol/L时会影响产量。但过高时一乃不经济，二则会出现非特异扩增及增加引物二聚体的产生。

3.热稳定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）

一般用量为2.5 U/100uL 反应体积。酶量过多易导致非特异性产物的产生。适温度为75℃，在低温下仍保留相当高的活性，易引起不完全配对的引物伸及引物二聚体的扩增延伸，所以应注意防止非特异性产物的出现。

4.dNTPs

PCR常用的dNTP浓度在50-200umol/L。四种

低则反应速度下降，过高则特异性下降，可根据具体实验来确定最适的

5.PCR缓冲液

因PCR反应中的dNTP能与Mg2+结合，影响反应液中游离应按不同条件，确定合适的Mg2+浓度。一般在标准的Mg2+浓度约为1.5mmol/L。Mg2+离子浓度可显著影响出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。应用无核酸酶的及5mmol的二硫苏糖醇（DTT）对酶有一定的保护作用。

6.PCR循环的温度

预变性：起始变性的时间应该长些，以使变性充分。一般为不完全时，DNA双链会很快复性，影响PCR反应，但若变性温度太高（不宜超过会影响Taq酶的活性。

变性：一般为94℃ 30s或95℃ 20s。

引物退火：应根据具体反应中引物与模板的碱基配对情况及实验的目的确定。一般为50-72℃。退火温度增高会增强对不正确退火引物的识别，还能降低引物酸的错误延伸。

延伸：一般为72℃ 60-90s。最后一个循环后应在物合成的完整性。

7．平台效应和PCR循环的次数

dNTPsPCR反应中（PCR的产量及产物特异性。BSA 72℃保留该类酶的最-模板的非特异延

dNTP浓度。Mg2+的浓度，所以dNTP浓度200umol/L），浓度高则Tween-20(0.05%～0.1%)94℃ 3-5min。变性95℃），3，端不正确核苷5min，以保证PCR产应等当量。浓度、在PCR基因扩增的后期，由于产物的堆积，将使原来产物以指数增加的速度变为平坦曲线，即所谓平台效应。它的出现是由于PCR原料的不断消耗、酶的稳定性的降低、终产物的阻滞效应及非特异性产物等多种因素造成的，所以选择合理的循环次数，既能得到足够量的PCR产物，又不要无意义地增加循环次数。

8.操作环境

避免环境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目标DNA的污染等。

实验九 琼脂糖凝电泳分离与纯化目的一、实验原理

不同大小的片段分离位于不同的位置，的片段。有许多型号的低熔点琼脂糖可在双链DNA的解链温度高于收DNA片段。该法的优点是可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成同位素探针、进行限制酶切割和连接反应等。

二、仪器及试剂：

1.仪器

电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心管、吸头等。

2.试剂：

低熔点琼脂糖、待纯化的

三、操作步骤：

1.配制1％的琼脂糖凝胶，在适当的位置切一条与加样槽平行的槽，换低熔点琼脂糖凝胶。

2.加样，100V

DNA DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在电泳过程中切下目的片段并采用低熔点琼脂糖回收法即可获得目65℃时熔化成液体，在65℃，所以可以熔化凝胶而 DNA、凝胶回收试剂盒、去离子水或38

30℃时凝固成凝胶。由于DNA并不变性，在凝胶成液态时回TE（pH7.6）

分离和纯化。

电泳，观察所需片段是否移至低熔点胶内。3.在紫外灯下切含有DNA的低熔点胶，置1.5 ml离心管中，于70℃热水中熔化。

4.按凝胶回收试剂盒说明书操作。

12.取适量纯化好的目的DNA在 GeneQuant 中检测，确定纯度和浓度，其余样品于-20℃保存。

四、注意事项：

1.配凝胶的三角瓶、电泳槽和配胶板要先冲洗干净

实验十

DNA重组

一、实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA用，形成磷酸二酯键的过程。常用的DNA连接酶有两种：菌DNA连接酶。其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接末端，应用更广泛。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分连接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶―随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5¹端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。③链3¹端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5¹端的磷酸根形成磷酸二酯键，完成DNA之间的连接。T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和温度和pH条件下进行连接反应。

二、仪器及试剂：

1.仪器：

台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等。

2.试剂：

T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶缓冲液、载体

三、操作步骤

1.外源DNA片段和载体DNA的连接

DNA5¹端磷酸和3¹端羟基之间相互作T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆3步：①首先，ATP与T4ATP复合物。②被激活的并释放出ATP作为辅助因子，DNA、外源DNA。DNA的平DNAAMPDNAAMP，在一定的 叫做重组子。片段的噬菌体

取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer

2.5 ul

酶切后的DNA片段

*1

约0.3 pmol

酶切后的载体DNA *2

约0.03pmol

T4 DNA Ligase

ddH2O

*1 DNA片段的摩尔数应控制在载体

*2 相同末端的载体与DNA自身环化。

2.盖好盖子，用手指轻弹Ep

3.将反应管放入16℃过夜反应（4.取出约25ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，片段和酶切DNA片段作电泳。

5.用0.1×TE将连接混合物稀释至

四、注意事项

1.连接产物经鉴定后应迅速做转化实验。

2.根据具体情况调节酶的用量。平端连接或接头连接都比黏端连接慢得多，而且酶的用量也增大。

3.单价阳离子或低浓度的聚乙二醇可提高平端连接的效率。

4.防止载体DNA自身环化，常用碱性磷酸酶处理线性载体，去掉载体的DNA片段的自身环化。

5.正确调整载体DNA和外源

五、相关问题

1.连接反应的影响因素

1ul

加至 25ul DNA摩尔数的3－12～16h）。鉴定连接结果，50ul，使用10～20ul DNA之间的比例有助于获得高产量的重组产物。40

10倍。2s 以集中溶液。以未经连接的质粒 5¹?CDNA

片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其管数次，并于台式离心机离心转化大肠杆菌感受态细胞。磷酸以抑制

除了载体、供体的浓度及其比例等因素外，影响连接反应的因素还有很多，如缓冲液组分、连接温度与时间、酶浓度、DNA浓度及片段末端的碱基序列等。

（1）连接缓冲液的影响

不同的公司提供的连接缓冲液可能有所不同，但大体上都含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。

（2）pH的影响

一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。

（3）ATP浓度的影响

连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。

（4）连接温度与时间的影响

因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃ 30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃ 60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。

（5）酶浓度的影响

根据New England Biolabs公司对T4 DNA连接酶的定义，1U的酶可在16℃ 30min内连接20ul体系中Hind Ⅲ酶切片段（黏性末端为0.12umol/L 5,末端，此时DNA质量浓度约为300ng/ul）的50%。日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍，厂商为了满足这一要求，又往往提供高浓度的酶（几百个 41 单位/ul），所以进行黏末端连接时需先行稀释。除了立即用于反应的部分可用酶反应缓冲液稀释外，其余都应使用厂商提供的稀释液。稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。

（6）DNA浓度的影响

尽管有的实验手册上推荐使用0.1-1nmol/L的DNA浓度，但考虑到用质粒作为载体克隆时，最后要求得到环化的有效连接产物，所以DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。相比较而言，以噬菌体、cosmid质粒为载体的克隆过程最后要求线性化的连接产物，所以，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。此外，在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。

2.三种连接酶单位定义

（1）Weiss单位

连接酶单位最早是1968年由Weiss提出的Weiss单位，现也称PPi单位。他的单位定义为：37℃ 20min内将1nmol的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上所需的酶量。现在大多数厂商仍使用这种单位。

（2）d（A-T）环化单位

由于Weiss单位定义中测试的是T4 DNA连接酶中除连接功能外的另一种磷交换功能，并且测试温度高达30℃，与实际连接反应相比无论在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich与Lehman提出了真正度量连接功能的d(A-T)环化单位，又称外切酶抗性检测。d（A-T）环化单位的定义为：30℃ 30min 内将100nmol/L的d（A-T）（约2kb长）转化成抗外切酶的形式。

（3）黏性末端单位

与Weiss单位相比，d（A-T）环化单位更接近实际，但仍有一定的问题，例如，环化单位测试中用的是纯AT片段，与实际连接中4种碱基随机排列不符；再说，如果连接酶将片段连接成多聚体而末环化时，仍可能被外切酶组所切；除此之外，与实际上大多数连接反应使用的温度16℃相比，30℃仍显得偏高。为了衡量实际连接条件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最实用的黏性末端单位，它的单位定义为：16℃ 30min内将5,末端浓度为0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片段的50%连接上。

实验十一 动物组织细胞总RNA的提取

一、实验原理

RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制并有助于除去非核酸成分。

本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总

二、仪器和试剂

1.仪器：

超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80

2.试剂：

(1)细胞裂解液：

异硫氰酸胍

4mol/L

柠檬酸钠（pH7.0）

25mmol/L

十二烷基肌氨酸钠

0.5%

RNA进行操作在分子生物学NorthernRNA的质量。由于细胞RNA时要利用高浓度的蛋白RNA。再通过酚、氯仿等有RNA。在提取的过程中要RNase的环境RNase活RNase活性。RNA并通过电泳 进行鉴定。振荡器、移液器、0.1% DEPC浸泡 因此提取必须在无凝胶成像系统、℃烘烤干燥方可使用。

β-巯基乙醇

0.1mol/L

称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存备用。

(2)10×凝胶缓冲液：

吗啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0）

200mmol/L

NaAc

EDTA(pH 8.0)

过滤除菌后避光保存。

（3）5×变性上样缓冲液：

水饱和的溴酚蓝

500mmol/LEDTA(pH 8.0)

甲醛（37%）

甘油

甲酰胺

10×凝胶缓冲液

加无RNase水至10ml，4℃可保存

（4）TRIzol RNA抽提试剂

（5）2mol醋酸钠

（6）0.1% DEPC

(7)平衡酚：氯仿：异戊醇（（8）平衡酚、氯仿

（9）无水乙醇、70%乙醇、异丙醇

100mmol/L

10mmol/L

16μl

80μl

720μl

2ml

3084μl

4ml 3个月。25：24：1）

(10)无RNase水

三、操作步骤

（一）异硫氰酸胍法（PLT）

1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

2.加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。

3.加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。

4.将混合物转移至1.5ml Ep管中，4℃，离心10 000r/min,20min.5.移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置?C20℃，30min沉淀RNA.6.4℃，离心12 000r/min，15min.7.弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10 000r/min，10min。

8.弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。

9.加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），?C70℃保存。

（二）TRIzol试剂提取RNA

1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol液 1ml 于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室温下静置5min。

2.加入200μl氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min。

3.4℃，10 000r/min离心15min，RNA分布于水相中。

4.将上层无色水相转移到另一Ep管中，加入500μl 异丙醇，室温静置10min。

5.4℃，10 000r/min离心10min。

6.弃上清液，用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4℃，7500r/min离心5min。

7.弃上清液，室温干燥15min.45

8.向干燥过的沉淀物中加入200μl DEPC处理水（无核水）溶解沉淀物，于-20℃保存备用。

（三）RNA检测

1.在紫外分光光度计上检测RNA浓度及纯度。

方法同实验四，用DEPC处理水校正零点；用DEPC处理水稀释RNA样品；读取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。

2.琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测

（1）制备凝胶（1.2%）。称1.2g琼脂糖，加72ml DEPC处理水，加热熔化。冷却至60℃，在通风橱内加入10×凝胶缓冲液10ml，甲醛（37%）18ml，混匀后，倒胶。

（2）制备样品。在离心管中，将RNA样品与5×变性上样缓冲液以4：1温育5～10min，迅速在冰上冷却5min，离心数秒。

（3）上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品卷入上样孔。以5V/cm的电压电泳2h.。

（4）待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3～4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙啶溶液μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配制）中染色约30min。

（5）在凝胶成像系统观察并分析。

四、注意事项

1.RNA是极易降解的核酸分子。因此提取总RNA必须在无RNase 环境中，戴口罩、手套、使用无RNase污染的试剂、材料、容器。

2.所有溶液应加DEPC至0.05%～0.1%，室温处理过夜，然后高压处理或加热至小时或60℃过夜，以除去石油残留的DEPC。

3.所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺，所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA酶活性。

4.根据RNA样品的紫外吸收OD值，可计算出RNAd 浓度。

单链RNA [ssRNA]=40×（OD260-OD310）×稀释倍数

纯RNA OD260 / OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,说明有蛋白质等污染，/氯仿在抽提。若比值低于2.0,表明有盐、胍、糖可用LiCL选择沉淀RNA以除去杂质。

65℃1.5～（0.570℃ 1 应用酚 混匀。

5.RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase.。28S和18S RNA比值约为2：1,表明RNA无降解。如比值逆转，则表明RNA降解。电泳中如果在28S 后方还有条带，表明有DNA污染，应用DNase处理后再进行纯化。

主要参考书：

1..金冬雁等译.分子克隆实验指南.第二版.北京：科学出版社，1995

2.子颖等译.精编分子生物学实验指南

3.周俊宜编.分子生物学基本技能和策略

4.姜泊等编.分子生物学常用实验方法

5.刘进元等编.分子生物学实验指导

.科学出版，.科学出版社.北京：人民军医出版社，.北京：清华大学出版社，47

1996.2002.

三. 分子生物学实验员工作总结

盛望

导师基本情况：

盛望，北京市特聘教授，生物医学工程专业博士生导师。出生于1968年5月。1994年赴法国留学，并与1996年和2001年分别获得里昂第一大学病毒学硕士和病毒博士学位。2001－2005年在加拿大多伦多大学进行博士后研修。2005年10月受聘北京工业大学生命科学与生物工程学院特聘教授。

主要研究方向：

1. 病毒在肿瘤的发生和发展中的作用，及抗病毒药物和疫苗的'研究。

2. 干细胞的分化。

课题基金：

获得北京市自然科学基金和北京市教委基金的资助

部份论文：

1.Sheng W, Wang G, La Pierre DP, Wen J, Deng Z, Wong CK, Lee DY, Yang BB. (2006) Versican Mediates Mesenchymal-Epithelial Transition. Mol Biol Cell. Apr;17(4):2009-20.

2.Sheng W, Wang G, Wang Y, Liang J, Wen J, Zheng PS, Wu Y, Lee V, Slingerland J, Dumont D, Yang BB.. (2005) The roles of versican v1 and v2 isoforms in cell proliferation and apoptosis. Mol Biol Cell. Mar;16(3):1330-40.

3.Sheng W., Bouguermouh A., Bouzid M., Djennaoui D. and Ooka T. (2004) BAM HI DNA Fragment H-Polymorphism of Epstein-Barr Virus is Associated with the Mutations Present in an 89 BP Sequence Localized in EBNA2 Gene. Virus Genes. Aug; 29(1): 99-108.

4.Sheng W., Decaussin G., Ligout A. and Ooka T. (2003) BARF1 gene encoded by Epstein-Barr virus contributes to the malignant phenotype and to apoptosis resistance in Burkitt's lymphoma cell line Akata. Journal of Virology, 77(6): 3859-65.

5.Sheng W., Decaussin G., Sumner S. and Ooka T. (2001) N-terminal domain of BARF1 gene encoded by Epstein-Barr virus is essential for malignant transformation of rodent fibroblasts and activation of BCL-2. Oncogene 20 (10): 1176-1185.

6.Wu Y. Sheng W. Cheng L Dong H., Lee V., Lu F., Wong C.S., Lu W. Y. and Yang B.B (2004) Versican V1 isoform induces neuronal differentiation and promotes neurite outgrowth. Mol Biol Cell. May; 15(5): 2093-104.

7.Wu Y., Chen L., Cao L., Sheng W. and Yang B.B. (2004) Overexpression of the C-terminal PG-M/versican domain impairs growth of tumor cells by intervening in the interaction between epidermal growth factor receptor and beta1-integrin. J Cell Sci. May 1; 117(Pt 11): 2227-37.

8.Zheng P. S., Wen J. P., Ang L. C., Sheng W., Viloria-petit A., Wang Y., Wu Y. Kerbel R. S.and Yang B.B. (2004) Versican/PG-M G3 domain promotes tumor growth and angiogenesis. FASEB J. Apr; 18(6): 754-6.

9.Kiani C., Chen L., Lee V., Zheng P.S., Wu Y., Cao L., Adams M.E., Sheng W. and Yang B.B. (2003) Identification of the motifs and amino acids in aggrecan G1 and G2 domains that inhibit product secretion. Biochemistry. Jun 17; 42(23): 7226-37.

10.Guo X., Sheng W., Zhang Y. Malignant transformation of monkey kidney epithelial cell induced by EBV BARF1 gene and TPA. . (2001) Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. Dec; 15(4): 321-3. Chinese.

11.Bouzid M., Sheng W., Buisson M., Bouguermouh A., Morand P., Seigneurin JM and Ooka T. (1998) Different distribution of H1-H2 Epstein-Barr virus variant in oropharyngeal virus and in biopsies of Hodgkin's disease and in nasopharyngeal carcinoma from Algeria. International Journal of Cancer 77(2): 205-210.

联系方式：

Email: shengwang@bjut.

四. 分子生物学实验员工作总结

分子生物学（Molecular Biology）

（50学时）

一、前言

本课程面向生物技术专业和生物科学专业，学时50，学分3，属于专业必修课，先修课程为生物化学。

二、课程的性质、地位和任务：

本课程首先介绍分子生物学的含义,它在生命科学中的位置、发展现状及展望以及基因组织包括DNA结构、复制、突变、修复和重组。同时兼顾学科发展动向,着重涉及当今分子生物学应用技术即分子克隆工具酶、电泳技术、载体、DNA及RNA制备、构建DNA文库、遗传转化、基因表达、PCR、RFLP、RAPD,还介绍了蛋白质合成及分析。旨在使研究生了解现代分子生物学理论的新进展并为相关学科从分子水平上阐明问题提供知识和技术。

三、教学基本要求和方法：

通过对本课程的学习，要求学生掌握基因概念在分子水平上的发展与演变、基因的分子结构和特点、基因的复制、基因表达（在转录、翻译水平）的基本原理、基因表达调控的基本模式、基因发生突变与交换及DNA遗传多型性检测的分子生物学原理。

四、授课教材及主要参考书目 教材：

P.C.Turner,A.G.McLennan,A.D.Bates&M.R.H.White 1999 分子生物学（Molecular Biology）科学出版社

参考书目：

黄翠芬 1987 遗传工程理论和方法 科学出版社 盛祖嘉等 1988 分子遗传学 复旦大学出版社 齐义鹏 1989 基因工程原理和方法 武汉大学出版社 吴乃虎 1991 基因工程原理 高等教育出版社 1998 基因工程原理(第二版)科学出版社 金冬雁 黎孟枫等译 1992 分子克隆实验指南 科学出版社 谢友菊 1992 遗传工程概论 北京农业大学出版社 阎隆飞、张玉麟 1993 分子生物学 北京农业大学出版社 阎隆飞、张玉麟 1997 分子生物学(第二版)北京农业大学出版社 徐洵、刘震乾 1993 DNA重组技术 科学出版社 卢圣栋 1993 现代分子生物学实验技术 高等教育出版社 李德葆 徐平1994 重组DNA原理和方法 淅江科学技术出版社 孙志贤 1995 现代生物化学理论与研究技术 军事医学科学出版社 林万明等 1995 PCR技术操作和应用指南 人民军医出版社 金冬雁 1996 英汉分子生物学与生物工程词汇 科学出版社 1998 基因及其操作原理 武汉大学出版社 金冬雁等 1996 核酸和蛋白的化学合成与序列分析 科学出版社 夏其昌 1997 蛋白质化学研究技术与进展 科学出版社 科学出版社名词室 1997 英汉生物学词汇（第二版）科学出版社 朱玉贤等 1997 现代分子生物学 高等教育出版社 瞿礼嘉等 1998 现代生物技术导论 高等教育出版社 Robert.F.Weaver 2000 分子生物学(in English)科学出版社 Sambrook J.等 1982 Molecular Cloning;A Laboratiry Manual 1989(2nd edition)Cold Spring Harbor Laboratory Press Turner等 1999 分子生物学(in English)科学出版社

五、教学内容及学时分配： 第一章 细胞与大分子（2学时）

1、目的要求：掌握细胞和大分子的分类及用以分析的一些方法。

2、要点： 第一节 细胞分类

1.真细菌 2.古细菌 3.真核生物 4.分化 第二节 亚细胞器

1.细胞核 2.线粒体与叶绿体 3.内质网 4.微体 5.细胞器的分离 第三节 生物大分子

1.蛋白质和核酸 2.多糖 3.脂类 4.复杂大分子 第四节 大分子的组装

1.蛋白质复合体 2.核蛋白 3.膜

4.非共价相互作用

第二章 原核与真核生物的染色体结构（2学时）

1、目的要求：掌握DNA如何整合进原核和真核生物复杂的基因组中。

2、要点

第一节 原核生物的染色体结构

1.大肠杆菌染色体 2.DNA结构域 3.基因组超螺旋 4.DNA结合蛋白 第二节 染色质结构

1.染色质 2.组蛋白 3.核小体 4.H1的功能 5.连接DNA 6.30nm纤丝 7.高级结构

第三节 真核生物的染色体结构

1.有丝分裂染色体 2.着丝粒 3.端粒 4.间期染色体 5.异染色质 6.常染色质 7.DNaseⅠ超敏性 8.CpG甲基化 9.组蛋白变异体和修饰 第四节 基因组复杂度

1.非编码DNA 2.复性动力学 3.单一序列DNA 4.串联基因簇 5.分散重复DNA 6.卫星DNA 7.遗传多态性 第五节 遗传信息流

1.中心法则 2.原核基因表达 3.真核基因表达

第三章 DNA复制（4学时）

1、目的要求：重点掌握DNA复制的过程，DNA复制在原核生物与真核生物中的区别。

2、要点：

第一节 DNA复制概述

1.半保留机制

2.复制子、复制起点与终点 3.半不连续复制 4.RNA引导 第二节 细菌的DNA复制

1.实验系统 2.起始 3.解旋 4.延伸 5.终止与分离 第三节 细胞周期

1.细胞周期 2.细胞周期4个时期 3.检验点及其调控

4.细胞周期蛋白和依赖于细胞周期蛋白的激酶 5.E2F和RB的调控

6.细胞周期的激活、抑制与癌症 第四节 真核生物的DNA复制

1.实验系统 2.起始点与起始 3.复制叉 4.核基质 5.端粒的复制

第四章 DNA损伤、修复与重组（4学时）

1、目的要求：了解导致DNA损伤的因素，掌握基因诱变、DNA重组和DNA修复的概念和方法。

2、要点： 第一节 诱变

1.突变 2.复制忠实性 3.物理诱变剂 4.化学诱变剂 5.直接诱变 6.间接诱变 第二节 DNA损伤

1.DNA损伤 2.氧化性损伤 3.烷基化 4.聚化加合物 第三节 DNA修复

1.光复活 2.烷基转移酶 3.切除修复 4.错配修复 5.遗传性的修复缺陷 第四节 重组

1.同源重组 2.位点特异性重组 3.转座作用

第五章 基因操作（4学时）

1、目的要求：掌握现有的对DNA进行操作的技术，学习用简单的DNA克隆策略图说明问题。

2、要点：

第一节 DNA克隆概述

1.DNA克隆 2.宿主和载体 3.亚克隆 4.DNA文库 5.筛选文库 6.克隆分析 第二节 质粒DNA的制备

1.载体质粒 2.质粒的小量制备 3.碱裂解 4.酚抽提 5.乙醇沉淀 6.氯化铯梯度 第三节 限制酶与电泳

1.限制性内切核酸酶 2.识别序列 3.黏末端 4.限制性酶解 5.琼脂糖凝胶电泳 6.DNA片段的分离

第四节 连接、转化与重组体分析

1.DNA连接 2.重组DNA分子 3.碱性磷酸酶 4.转化 5.筛选 6.转化率 7.筛选转化子 8.转化子的增殖与保存 9.凝胶分析 10.插入片段定向

第六章 克隆载体（4学时）

1、目的要求：了解常用的适合于各种用途的克隆载体。

2、要点：

第一节 质粒载体的设计

1.连接产物 2.双抗生素抗性 3.蓝—白颜色筛选 4.多克隆位点 5.已克隆插入片段的转录 6.表达载体 第二节 噬菌体载体

1.λ噬菌体 2.λ置换型载体 3.包装与侵染 4.噬菌斑的形成 5.λ溶原体 6.M13噬菌体载体 7.克隆到M13 8.质粒—M13杂合载体 第三节 黏粒、YAC与BAC 1.大片段DNA的克隆 2.黏粒载体 3.YAC载体

4.用酿酒酵母的筛选 5.BAC载体 第四节 真核生物载体

1.克隆到真核生物 2.转染真核细胞 3.穿梭载体 4.酵母附加型质粒 5.根癌农杆菌Ti质粒 6.杆状病毒 7.哺乳动物病毒载体 8.直接基因转移

第七章 基因文库与筛选（4学时）

1、目的要求：介绍用DNA文库来分离筛选新的基因序列的过程与方法。

2、要点：

第一节 基因组文库

1.具代表性的基因文库 2.文库大小 3.基因组DNA 4.载体 第二节 cDNA文库

1.mRNA分离、纯化与分级分离 2.cDNA的合成 3.cDNA末端的处理 4.与载体的连接 第三节 筛选流程

1.筛选 2.菌落及噬菌斑杂交 3.表达筛选 4.杂交扣留与释放 5.染色体步移

第八章 克隆DNA的分析与应用（2学时）

1、目的要求：了解涉及DNA测序和克隆序列分析方面的一些更加复杂和详细的方法，熟练掌握PCR技术的原理和过程。

2、要点：

第一节 克隆的鉴定

1.鉴定 2.限制图谱 3.部分酶解 4.核酸标记 5.DNA和RNA杂交 第二节 核酸测序

1.DNA测序 2.RNA测序 3.序列数据库 4.序列分析 5.基因组测序计划 第三节 聚合酶链式反应

1.PCR 2.PCR循环 3.模板 4.引物 5.酶

6.PCR的条件优化 7.PCR派生技术 第四节 克隆基因的组构

1.组构

2.在基因组DNA上定位cDNA 3.S1核酸酶作图 4.引物延伸 5.凝胶阻滞 6.DNaseⅠ足迹法 7.报道基因 第五节 克隆基因的诱变

1.缺失突变 2.定点诱变 3.PCR诱变 第六节 克隆技术的应用

1.应用 2.重组蛋白 3.遗传修饰生物体 4.DNA指纹分析 5.医学诊断 6.基因治疗

第九章

原核生物的转录（3学时）

1、目的要求：熟练掌握原核生物基因转录的原理、过程。

2、要点：

第一节 转录的基本原则

1.转录概述 2.起始 3.延伸 4.终止

第二节 大肠杆菌RNA聚合酶

1.大肠杆菌RNA聚合酶 2.α亚基 3.β亚基 4.β’亚基 5.σ因子 第三节 大肠杆菌σ70启动子

1.启动子序列 2.启动子大小 3.-10序列 4.-35序列 5.转录起始点 6.启动子效率

第四节 转录的起始、延伸与终止

1.启动子结合 2.DNA解旋 3.RNA链起始点 4.RNA链延伸 5.RNA链终止 6.依赖ρ的转录终止

第十章

原核生物的转录调控（3学时）

1、目的要求：熟练掌握一些被细菌用来调控特定基因表达的精细机制。

2、要点：

第一节 乳糖操纵子

1.操纵子 2.乳糖操纵子 3.乳糖阻抑物 4.诱导 5.cAMP受体蛋白 第二节 色氨酸操纵子

1.色氨酸操纵子 2.色氨酸阻抑物 3.弱化子 4.前导RNA结构 5.前导肽 6.弱化作用 7.弱化的重要性

第三节 不同σ因子对转录的调节

1.σ因子 2.启动子识别 3.热休克

4.枯草杆菌的孢子形成 5.噬菌体σ因子

第十一章

真核生物的转录（2学时）

1、目的要求：熟练掌握真核生物基因转录的基本原理和过程。

2、要点：

第一节 三种RNA聚合酶：性质与功能

1.真核生物RNA聚合酶 2.RNA聚合酶亚基 3.真核生物RNA聚合酶的活性 4.RNA聚合酶Ⅱ的CTD 第二节 RNA聚合酶Ⅰ基因：核糖体重复

1.核糖体RNA基因 2.核仁的作用 3.RNA聚合酶Ⅰ启动子 4.上游结合因子 5.选择因子1 6.TBP与TAF1 7.其他rRNA基因

第三节 RNA聚合酶Ⅲ基因：5S基因与tRNA基因的转录

1.RNA聚合酶Ⅲ 2.tRNA基因 3.5S rRNA基因

4.可变的RNA聚合酶Ⅲ启动子 5.RNA聚合酶Ⅲ的终止

第四节 RNA聚合酶Ⅱ基因：启动子与增强子

1.RNA聚合酶Ⅱ 2.启动子 3.上游调控元件 4.增强子

第五节 通用转录因子与RNA聚合酶Ⅱ的起始

1.RNA聚合酶Ⅱ的基本转录因子 2.TFⅡD 3.TBP 4.TFⅡA 5.TFⅡB与RNA酶的结合 6.RNA聚合酶进入之后的结合因子 7.TFⅡH作用下的CTD磷酸化 8.起始转录复合体

第十二章

真核生物的转录调控（2学时）

1、目的要求：掌握一些重要的真核细胞基因的转录调控的例子。

2、要点：

第一节 真核生物的转录因子

1.转录因子结构域结构 2.DNA结合结构域 3.二聚体结构域 4.转录激活结构域 5.阻抑物结构域 6.转录调控的对象 第二节 转录调控举例

1.组成性转录：SP1 2.激素调控：类固醇激素受体 3.磷酸化调控：STAT蛋白 4.转录延伸：HIV Tat 5.细胞决定：myoD 6.胚胎发育：同源域蛋白

第十三章 RNA加工与核糖核蛋白复合体（4学时）

1、目的要求：熟练掌握从新生RNA到成熟RNA分子的加工过程。

2、要点：

第一节 rRNA加工与核糖体

1.RNA的加工类型 2.原核生物的rRNA加工 3.真核生物的rRNA加工 4.核糖核蛋白复合体及其研究 5.原核生物的核糖体 6.真核生物的核糖体

第二节 tRNA的加工、RNA酶P和核酶

1.原核生物的tRNA加工 2.真核生物的tRNA加工 3.核糖核酸酶P 4.核酶

第三节 mRNA加工、hnRNP和snRNP 1.mRNA的加工 2.hnRNP 3.snRNP颗粒 4.5’端加帽 5.3’端剪切及加尾 6.剪接

7.前mRNA的甲基化 第四节 可变mRNA加工

1.可变加工 2.可变poly(A)位点 3.可变剪接 4.RNA编辑

第十四章

遗传密码与tRNA（2学时）

1、目的要求：掌握遗传密码的特点以及tRNA在翻译过程中的作用。

2、要点： 第一节 遗传密码

1.特性 2.破译 3.特征 4.突变的效应 5.通用性 6.可读框 7.重叠基因

第二节 tRNA的结构与功能

1.tRNA的一级结构 2.tRNA的二级结构 3.tRNA的三级结构 4.tRNA功能 5.tRNA的氨酰化 6.氨酰tRNA合成酶 7.校正

第十五章

蛋白质合成（4学时）

1、目的要求：熟练掌握RNA通过遗传密码翻译成成熟蛋白质序列的过程。

2、要点：

第一节 蛋白质合成概述

1.密码子与反密码子的相互作用 2.摆动现象 3.核糖体结合位点 4.多聚核糖体 5.起始tRNA 第二节 蛋白质合成机制 1.基本过程 2.起始 3.延伸 4.终止

第三节 真核生物蛋白质合成的起始

1.基本过程 2.扫描 3.起始 4.延伸 5.终止

第四节 翻译调控与翻译后加工

1.翻译调控 2.多蛋白 3.蛋白质定位 4.蛋白质修饰 5.蛋白质降解

第十六章

噬菌体与真核生物病毒（2学时）

1、目的要求：掌握重要的原核生物和真核生物病毒，了解它们对我们理解分子信息处理所作的贡献。

2、要点： 第一节 病毒简介

1.病毒 2.病毒基因组 3.复制策略 4.病毒毒性 第二节 噬菌体

1.一般特性

2.裂解性与溶源性侵染 3.噬菌体M13 4.λ噬菌体 5.转座噬菌体 第三节 DNA病毒

1.DNA病毒基因组：复制与转录 2.较小DNA病毒 3.较大DNA病毒 4.单纯疱疹病毒-1 第四节 RNA病毒

1.RNA病毒基因组的一般特性 2.病毒的反转录 3.反转录病毒 4.致癌性反转录病毒

5.反转录病毒基因组结构及其表达 6.反转录病毒的突变率

第十七章

肿瘤病毒与癌基因（2学时）

1、目的要求：从病毒的研究的进展以及分子生物学其他领域的知识累积了解癌症的发生机制。

2、要点：

第一节 肿瘤病毒中的癌基因

1.癌症 2.癌基因

3.致癌性反转录病毒 4.癌基因的分离 第二节 癌基因的分类

1.癌基因与生长因子 2.核癌基因 3.癌基因间的协同作用 第三节 肿瘤抑制基因

1.概述

2.肿瘤抑制基因存在的证据 3.RB1基因 4.P53基因 第四节 凋亡

1.凋亡

2.损伤或危险性细胞的清除 3.凋亡过程中细胞变化 4.线虫中的凋亡作用 5.哺乳动物中的凋亡 6.凋亡在疾病和癌症中的作用福建农林大学生物科学专业

本科生《生物化学与分子生物学实验》教学大纲

80学时 3学分

一、课程的性质和任务

分子生物学和生物工程学是两门新兴的学科，无论对基础理论研究，还是生产实践都将产生巨大的影响。生物化学与分子生物学是这两门学科的重要基础，是一门实践性很强的实验课程。掌握和应用生物化学与分子生物学实验技能，是学好这一课程的必要条件。

生物化学与分子生物学实验技术不仅是生物化学教学重要的组成部分，而且在培养学生分析和解决问题的能力，严谨的科学态度和独立工作的能力方面，有着不可替代的作用。

针对学生的培养方向，本课程以培养学生掌握生物技术与分子生物学研究的基础实验技能为主要目标，力图最大限度地利用我校现有的实验条件，使学生通过本课程的学习和实践，接触和掌握从事生物技术研究所必要的实验手段。通过有限的实验室实践，涵盖生物化学与分子生物学各个方面的实验内容，以点带面，突出重点，促进学生对生物化学与分子生物学课程学习内容的理解和掌握。

二、课程教学的基本要求

本课程的内容以蛋白质（含酶）、核酸及脂类的提取、分离、纯化及鉴定为重点，兼及这些内容的定性和基团鉴定，以及糖类．维生素的实验。本课程的实验安排考虑到与化学基础和后继的专业实验的衔接，尽量避免重复。在实验项目安排方面，主要涉及提取、透析、冻干、层析、电泳、分光、离心、浓缩、PCR、分子杂交和基因表达等基础实验技能的训练。在时间安排上，针对本科生的学习特点，尽量安排每一个实验可以在２－３小时内完成，在课程结束前，适当安排少量综合实验，以培养学生应用实验手段的综合能力。

本课程教学总时数为8０学时，实验技术原理采取以学生自习为主，课堂进行提要式的提示讲解和必要的答疑的方式，使学生掌握实验方法的基本原理和应用范围。本课程强调实验技能训练的重要性，主要课时安排学生实验，以便尽量提高学时利用率。为了节省基础设施投资，提高仪器利用率，本课程采取开放式集中实验的方式，要求学生在实施实验之前，必须做好预习准备，拟好实验方案，经任课教师认可后，方可进入实验室做实验。课堂讲授与实验课的比例为１：10。

我们在课程成绩评定上，不以一次考试定音的传统考试方式，而强调平时和考试并重，基础理论和实验技能相结合的综合评定方式（理论３０％，实验技能考试３０％，平时观察和记录４０％）。

三、课程教学大纲及学时分配 1 绪论（3学时）常用生物化学实验技术及原理（自学）2.1 样品处理 2.1.1 透析

2.1.2 薄膜浓缩与冷冻干燥 2.2 层析技术 2.3 电泳技术 2.4 光谱技术 2.5 离心技术 2.6 PCR技术 3 学生实验

3.1 氨基酸的分离鉴定───纸层析法（3学时）

了解层析技术的一般原理、分类及应用范围，重点掌握纸层层析法的原理及操作技术，用以分离游离氨基酸组分。3.2 多糖的薄层层析分离（5学时）

了解薄层层析的一般原理，掌握多糖的水解方法和硅胶G薄层层析的基本技术及其在可溶性糖分离鉴定中的应用。

3.3 琼脂糖凝胶柱层析测定蛋白质分子量及分子量分布（8学时）

通过采用琼脂糖凝胶柱层析测定蛋白质分子量及分子量分布，学习和掌握凝胶柱层析法的工作原理和基本操作技术。

3.4 大蒜细胞ＳＯＤ的提取与分离（6学时）

通过大蒜细胞SOD的提取与分离，学习和掌握蛋白质和酶的提取与分离的基本原理和操作方法。

3.5 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定蛋白质的相对分子量（8学时）

通过利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量实验，掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和操作方法，以及SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理和方法。3.6 酵母ＲＮＡ的提取与分离（8学时）

通过采用苯酚溶液提取法提取酵母RNA，采用地衣酚显色法测定RNA含量，学习和掌握RNA的分离与测定的基本原理和技术。3.7 植物ＤＮＡ的提取与测定（8学时）

通过采用SDS提取法提取花椰菜DNA，采用二苯胺显色法测定DNA含量，采用琼 脂糖凝胶电泳鉴定DNA，学习和掌握RNA的分离与测定的基本原理和技术。3.8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（3学时）

通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法和技术。3.9 质粒DNA的提取及酶切（8学时）

通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。3.10

DNA重组（2学时）

通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。3.11

DNA序列测定——银染色法（8学时）

通过本实验，掌握银染测序法。3.12 PCR基因扩增（6学时）

通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。4 实验技能考试（2学时）和实验基础理论考试（2学时）

四、参考文献

１

张立名，王贤舜： 现代生物化学分析原理，中国科学技术大学出版社，１９９１年４月第一版。

２

王重庆等： 高级生物化学实验教程，北京大学出版社，１９９４年６月第一版。３

张龙翔等：生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，１９９７年７月第二版。

４

赵亚华：生物化学实验技术教程，华南理工大学出版社，２０００年８月第一版。５

欧阳平凯：生物分离原理及技术，化学工业出版社，１９９９年２月第一版。６ 魏群：分子生物学实验指导，高等教育出版社，１９９９年１２月第一版。７ 杨安钢等：生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社，２００１年２月第一版。

８ 郭勇：现代生化技术，华南理工大学出版社，１９９６年８月第一版。

五. 分子生物学实验员工作总结

u orientation 反向（插入）[插入片段与载体方向相反]

ubiquitin 遍在蛋白，泛素[存在于一切真核生物的一种与组蛋白h2共价连接的蛋白]

ultraviolet crossliking 紫外线激发的交联[可用于分析dna结合蛋白]

uncoating 脱壳，脱（外）被[人见于病毒繁殖或受体介导的胞吞作用]

underwinding 欠旋[由负超螺旋引起]

urodilatan 尿舒张肽[一种心钠素衍生肽，可作用于心钠素受体]

uropontin 尿桥蛋白[与骨桥蛋白相关，可抑制草酸钙晶体（肾结石）的形成]

uvomorulin 桑椹（胚）粘着蛋白[一种依赖钙离子的细胞粘着分子，最初发现与鼠桑椹胚发育有关]

六. 分子生物学实验员工作总结

SectionA 1 三个域：真细菌，古细菌，真核生物 2 组装中的主要作用力：非共价健作用力

SectionB 1 蛋白质纯化的分析方法

正电荷：天冬氨酸 谷氨酸

负电荷：赖氨酸 精氨酸

组氨酸

极性：天冬酰胺 谷氨酰胺

苏氨酸 丝氨酸 半胱氨酸

非极性：脂肪族 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸

异亮氨酸 甲硫氨酸 脯氨酸

芳香族 苯丙氨酸

酪氨酸 色氨酸 Cys 二硫键 Gly 无手性 Pro 亚氨基酸

芳香族氨基酸最大吸收峰280mm 3 蛋白质的一级(决定蛋白折叠及其最后的形状的最重要的因素)：氨基酸脱水缩合形成肽链 N端到C端

共价键

二级：多肽链中空间结构邻近的肽链骨架通过氢键形成的特殊结构。

α转角

β螺旋 氢键为主要作用力

三级： 多肽链中的所有二级结构和其他松散肽链区域（散环结构）通过各种分子间作用力（非共价键为主），弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。

非共价键

四级： 许多蛋白分子由多条多肽链（亚基，subunits）构成。组成蛋白的各亚基以各种非共价键作用力为主，结合形成的立体空间结构即为四级结构。非共价键 偶极：电子云在极性共价键的两原子间不均匀分布，使共价键两端的原子分别呈现不同的电性

兼性离子：具有正电荷（碱性），又具有负电荷（酸性）的分子 双极性分子：

Section C 1核酸的光学特性：

增色性：一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力增加的现象 减色性：一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力减少的现象 Reason: 碱基环暴露在环境中的越多，对紫外的吸收力越强 Absorbance（吸收值）：Nucleotide > ssDNA/RNA > dsDNA 核酸的最大吸收峰260mm(碱基有芳香环)芳香族氨基酸最大吸收峰280mm A260/A280:

纯的 dsDNA：1.8 纯的 RNA：2.0 纯的 Protein：0.5 2 Tm 值（熔解温度）：热变性时，使得DNA双链解开一半所需要的温度。

Tm=2x(A+T)+ 4x(G+C)

Tm值与DNA分子的长度，及GC的含量成正比

Annealing（退火）:热变性的DNA经过缓慢冷却后复性

快速冷却： Stay as ssDNA

缓慢冷却: 复性成dsDNA 3 脱氧核糖核酸与核糖核苷酸得到画法 支持双螺旋结构的两个实验：查戈夫规则

X射线晶体衍射 5 双螺旋的内容：

双链之间的关系：DNA分子由两条链组成

双链反向平行(5’3’ 方向)

两链的碱基通过氢键互补配对，A:T;G:C。

双链序列反向互补

各基团排列方式：糖-磷酸骨架DNA分子排列在外;

碱基对平面相互平行，排列在DNA分子的内部。空间结构为：右手双螺旋结构

每转一圈~10个碱基对，每一圈长度33.2A

双链螺旋中形成大沟，小沟。碱对DNA的影响：高pH值对DNA的影响比低pH值的要小。

高 pH 值(pH>11)会改变碱基构象，使DNA变性（双链解旋，成单链）

RNA的影响：高pH值，2’羟基会攻击磷酸二酯键，使其断裂，形成2’，3’-环式磷酸二酯键，从而使RNA分子断裂 共价闭合环状DNA(convalently closed circular DNA, cccDNA）。即通过共价键结合形成的封闭环状DNA分子。超螺旋DNA（Supercoil DNA）:松弛型双链DNA进一步旋转后，再形成闭环结构时，就会形成DNA超螺旋结构

L=T+W 判断是否为超螺旋 正负超螺旋 拓扑异构酶：暂时断裂DNA分子中一条或两条单链上的磷酸二酯键，改变DNA分子的连接数及拓扑状态。

功能：消除DNA复制和转录等过程产生的超螺旋。

细胞中，Ⅰ型酶与Ⅱ型酶的活性保持一种平衡状态。Ⅱ型酶的“使DNA超螺旋化” 与Ⅰ型酶“使DNA松驰化” 相抗衡，从而使DNA保持适当的超螺旋密度。EB: 嵌入DNA配对碱基之间，使DNA分子在嵌入处局部解旋，增加ccDNA其它部位的正超螺旋 Type II RE

二型限制性内切酶:识别位点一般为４～8个碱基对的回文序列

如：EcoRI

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5

Section D 1 染色体的折叠：串珠结构 ：核心组蛋白:H2A, H2B, H3 and H4.连接组蛋白 H1

核小体

30nm纤丝

高级环状结构（染色质的最高结构）

紧密缠绕结构 着丝粒：两侧是大量的名叫卫星DNA的重复序列

端粒：上百个短的重复序列

作用：端粒DNA 形成特殊的环状二级结构，保护染色体末端不被核酸外切酶降解。

抵消DNA复制时每一轮复制都导致两末端形成的后随链比母链要短一截的现象对染色体的影响 异染色质：高度浓缩，无转录活性

常染色质：结构松散，有转录活性

DNaseI 敏感区域：对区域内DNA的转录活跃

串珠结构

DNaseI 超敏感区域：转录活跃的基因的调控区域

DNA裸露 4 原核染色体结构：非特异性DNA结合蛋白：类组蛋白

位点特异性DNA结合蛋白：与特殊的DNA序列结合

有其他特殊的生理功能：RNA polymerases

对结构域的形成也很重要

复性动力曲线：

Low C0t: 高重复 卫星DNA Moderate C0t : 中重复 串联基因簇

反转座子 High C0t :单拷贝或低重复

大肠杆菌基因组 染色体结构对基因转录的影响

CpG 抑制→CpG位点中的胞嘧啶的C-5常发生甲基化(CpG甲基化），CpG 甲基化可能可以DNA转录被限制→哺乳动物基因组中，有些区域含有很多未甲基化的CpG 位点，被称为CpG 孤岛。

甲基化—转录抑制

去甲基化—恢复转录

组蛋白的乙酰化：核心组蛋白N-端的Lys被乙酰化，DNA与核心组蛋白体解聚。Gene 表达被激活

去乙酰化：抑制 gene表达

组蛋白的磷酸化:对组蛋白 H1 磷酸化，抑制基因表达 其他组蛋白中心法则

Section E 1 DNA复制：细胞中，一条双链DNA分子通过碱基配对，形成两条与其序列相同的DNA双链分子的过程。2

确定DNA半保留复制

半不连续复制 3 复制的基本步骤 复制为双向

大肠杆菌的复制：

起始AT含量高的区域

参与蛋白：DnaA（复制起始因子)：识别并结合于重复序列上，驱使富含AT的重复序列解链，需负超螺旋，及ATP

DnaB(DNA解旋酶):DNA双链解旋，形成复制叉

SSB:(单链结合蛋白):保持解旋部分的单链状态

DnaG(引发酶/引物酶):RNA引物合成，引发复制 延伸

参与蛋白：DNA Pol III全酶：负责新链的合成:前导链，冈崎片段

DNA pol

I：复制中除去引物，填补引物处空缺

终止： 真核生物的复制：

一个细胞周期内，一个DNA分子只能复制一次

Section F 1 复制忠实性的机制：

DNA复制的高精度：模板连和进入核苷酸在DNA聚合酶的作用位点正确配对

3’到5’外切核酸酶对错误碱基的校正

错配修复 2 holiday模型 3

Section K 编码链 模板链 2 大肠杆菌的转录

RNAP酶：核心酶：a 亚基：aNTD对核心酶的组装很重要。

aCTD在识别启动子、调节转录水平中起着非常重要的作用。

b 亚基：RNAP的催化中心。

与模板DNA、RNA产物、及底物核糖核苷酸紧密结合。

抗生素利福平结合在在b 亚基上，可以抑制RNAP的转录活性。

利福平只抑制转录的起始。

利迪链菌素只抑制延伸而不抑制转录起始

b’ 亚基：可能与RNAP的催化有关。

肝素与b’亚基结合后，能干扰RNAP与DNA的结合，抑制转录。

w 亚基：可能与RNAP的组装及维持RNAP结构的稳定性有关

s factor(s因子)：s factor 在启动子特异性识别过程中至关重要 移动慢的原因：可以保持与翻译同步。

与有些基因转录调控相关。

有利于转录终止

RNAP没有3’ →5’外切酶活性，不能进行转录校正。其错配率达10-4。RNAP倒退暴露新合成的错配碱基，可以有利于其他辅助核酸酶将错配碱基切除，增加转录的忠实性。s70基础启动子的一般结构

-10 序列：它对转录起始时，RNAP打开DNA双链的过程非常重要。-

10序列到TSS位点的距离对转录效率也有很大的影响-35 序列：增强RNAP s factor 的识别能力及与DNA的结合能力 4 影响启动子效率的DNA序列：

核心启动子的序列：与保守序列越像，效率越高。

TSS周围序列：影响起始效率。

转录单位的前30个核苷酸的碱基序列：影响RNAP从启动子处移动出去（启动子区清空）的速率。

核心启动子附近的调控元件。转录的起始：开放复合物 闭合复合物 无效起始

延伸：启动子的清空，链的延伸转录泡，s因子的循环利用

终止：依赖性 不依赖性

反复重复序列

Section L 1.顺式作用元件（cis-acting elements）：一般为DNA上较为保守的、有着特异性序列或结构的特定区域。它们只能影响与其在同一条染色体上的基因的活动。如：启动子，转录激活因子结合位点等。

反式作用基因/调节基因（trans-acting genes，regulator genes）

可以影响与他们不在同一条染色体上的基因的表达水平的DNA元件。2 乳糖操纵子 色氨酸操纵子 正负调控都可以有诱导和阻遏两种调控方式。

正控诱导：诱导因子活化激活因子，使其可以增加基因的表达。（Lac operon，CRP调控）正控阻遏：共阻遏物使激活因子失活，减少基因的表达。负控诱导：诱导因子使阻遏蛋白失活，增加基因的表达。（Lac operon，lac repressor）负控阻遏:共阻遏物活化阻遏蛋白，使其可以降低基因的表达。（Trp operon，trp repressor）

Section M 增强子 沉默子 TFIID：可与多种核心启动子元件或特异性转录因子结合，启动二类转录预起始复合物组装的通用转录因子。

TBP(TATA-box binding protein):可识别并结合TATA-box TAFII（TBP-associated factor II）：TBP关联蛋白，TFIID中与TBP形成复合体的所有蛋白，～13个。

TFII H的结构与功能：蛋白激酶(4 个亚基)：催化蛋白磷酸化。将NTP（一般为ATP）的g-磷酸基团转移到蛋白上。

磷酸化 RNA pol II 中的CTD 结构域。TFIIE 刺激TFIIH介导的磷酸化反应。DNA 解旋酶/ATPase(5 亚基)：

水解ATP，利用其能量打开DNA的双链 TBP(TATA-binding protein): 确保 RNA Pol I能正确定位到转录起始区域上。

SP1 为组成性表达的转录因子，在所有的细胞中都存在，与基因本底表达水平有关 SL1，选择因子,RNA Pol I起始转录所必需的因子 CTD:羧基末端结构域，的磷酸化状态与转录进程有关

转录起始时期，CTD结构域一般处于去磷酸化形式，与结合启动子有关。

转录延伸时期，CTD结构域常处于磷酸化形式，与mRNA的加工有关。

Section N 1 DNA-binding domains（DBD）:DNA结合结构域

螺旋-转角-螺旋结构（域）

锌指结构（域）

碱性结构（域）

Dimerization domains：二聚体化结构域

亮氨酸拉链 螺旋 散环 螺旋 DBD+DM 激活结构域 酸性激活结构域 富含谷氨酰胺结构域 富含脯氨酸的结构域 LBD

Section O 真核生物中mRNA 加工的一般过程 5’加帽: CTD作用：转录起始时，参与加帽反应的三种酶结合在RNA Pol II的CTD结构域上。转录产物刚开始合成时，即对其5’端进行加帽反应。

作用：防止降解：核糖核酸酶一般不能降解帽结构中的三磷酸键

帮助转运mRNA到细胞质中

增强翻译水平：mRNA需要帽结合蛋白的帮助才能更好的与核糖体结合 帮助去除pre-mRNA中的第一个内含子。3’加Poly(A)尾：

作用：防止被核酸酶降解：增加mRNA的稳定性

有助于mRNA从细胞核到细胞质的转运

参与pre-mRNA的最后一个内含子的剪接。

增强mRNA的翻译水平，增加基因的表达 剪接 甲基化 2 核酶有：有催化功能的RNA即为核酶

U2 U6 RNAP 3 RNA的多样性：可变加工，反式剪接，RNA编辑 原核生物核糖体

真核生物核糖体 原核rRNA 加工的大致过程：形成多个茎环结构，与蛋白结合形成RNP，核苷酸修饰，逐级切割

真核rRNA 加工的大致过程：甲基化，切割。内含子剪接 原核tRNA 加工的大致过程:将多顺反子前体切割，分离出单顺反子前体

单顺反子前体进一步被切割，形成与成熟tRNA长度一致分子（RNases D, E, F，P

.碱基修饰，形成成熟tRNA 真核tRNA 加工的大致过程：5’-末端成熟，3’-末端成熟（添加5’-CCA-3’）去除内含子 7 miRNA and siRNA的调控机制：mRNA降解，抑制翻译，抑制转录

Section P 1 遗传密码的特性:

蛋白的编码信息由三联体密码子组成。

密码子为连续的，之间无间隔、无重叠。

除三个终止密码子之外，每个密码子对应一种氨基酸

有密码简并现象。即：多个密码子对应同一种氨基酸。

标准遗传密码子在各类生物中基本通用，不过少数生物体或细胞器中，有一些密码子对应的氨基酸与标准的不同。

生物对同义密码子的使用经常有偏好性。不同生物的密码子偏好性不同。

基因一般不重叠。一段核酸分子一般只有一个开放阅读框（open reading frame, ORF/可读框），被翻译成一个蛋白。

有些物种也有重叠基因的现象。开放阅读框:ORF 从起始密码子ATG 到终止密码子

TGA,TAA or TAG 之间的连续的蛋白编码序列

CDS 编码序列 当ORF可以预测一个蛋白时 3 tRNA 二级结构:三叶草结构 4 tRNA的特异性加载：（翻译的高保真性）

氨酰-tRNA合成酶对相应tRNA分子有很强的专一性：第二密码子：

氨酰-tRNA合成酶接受相应氨基酸时有很强的忠实性：校正：双筛选机制—酶的活性中心，酶中的编辑位点 氨酰-tRNA（AA-tRNA）： 3’-end加载了一个氨基酸的tRNA分子。是在蛋白质合成中，将密码子转换氨基酸的适配器。

Section Q 1 密码子与反密码子的反向互补配对 一个tRNA可识别的密码子数由反密码子的第一位碱基决定

摆动学说：第三位密码子与第一位反密码子的配对可以摆动

反密码子第一位为A或C时，配对无摇摆现象。3 核糖体的E，P，A位点 A位：接受AA-tRNA部位.除了起始氨酰-tRNA，其他所有AA-tRNA都只能进A位点。P位：肽酰基-tRNA结合部位。起始氨酰-tRNA也进入此位点。E位：空载tRNA离开核糖体的位点。4 核糖体各亚基的功能

核糖体小亚基功能：结合mRNA

促进密码子与反密码子的正确结合 mRNA移位

大亚基的功能A位、P位、肽酰转移酶（转肽酶）中心等在大亚基上。

负责携带AA-tRNA、肽键/肽链的形成 5 翻译的基本内容 核糖体与mRNA结合

氨酰tRNA逐个进入核糖体

氨酰tRNA通过反密码子与mRNA互补配对 氨酰tRNA分子的氨基酸之间形成肽键。空载tRNA的释放 肽链的释放

七. 分子生物学实验员工作总结

1.分子生物学总结知识点

a.生物概念

b.生物知识

c.实验知识

d.生物实验知识

e.生物概念

e.化学知识

2.生物学知识

a.生物概念

b.化学知识

c.生物实验

3.有条件生物学知识

★述职报告之家内容组内部评分TOP10:
• 分子生物学实验员工作总结 | 分子生物学技术支持工作总结 | QC微生物实验员工作总结 | 实验员工作总结 | 分子生物学实验员工作总结 | 分子生物学实验员工作总结

a.生物知识

b.生物实验

c.化学实验

4.化学知识

a.生物学知识

b.化学实验

c.生物实验

d.化学知识

5.化学知识

a.生物实验

b.生物实验

c.化学实验

6)

有条件生物

a.生物实验

b.生物实验

d.化学实验

7.生物化学知识

b.化学实验

8)

有条件生物

b.生物实验

c.生物化学实验

9)

有条件生物

a.生物实验

b.生物实验

c.

生物实验

d.

生物实验

10)

有条件生物

a.生物实验

b.生物实验

c.生物实验

d.

物理实验

11)

有条件生物

b.生物实验

c.生物实验

12)

有条件生物

a.生物实验

b.生物实验

c.生物实验

d.

实验

13.有条件生物的有条件生物有条件

八. 分子生物学实验员工作总结

学 校：北京协和医学院

求职意向

到岗时间：可随时到岗

工作性质：全职

希望行业：制药/生物工程

目标地点：北京

期望月薪：面议/月

目标职能：药物产品主管

工作经验

/10 – /8：XX有限公司[10个月]

所属行业：制药/生物工程

产品部药物产品主管

1. 组建销售队伍，培训销售人员，负责完成公司产品在辖区的`销售目标任务。

2. 负责制定年度销售计划与预算，进行辖区的市场开发，保证客户开发数量和质量。

3. 进行辖区内中药材市场调研，收集相关公司和产品的信息，提交分析报告。

/6 – 2014/9：XX有限公司[1年3个月]

所属行业：制药/生物工程

采购部 制药采购员

1. 负责协助供应商改善生产加工场所及设备、提高供应商质量保证。

2. 与供应商联系报价并完成价格核算及合同拟定、执行情况跟踪。

3. 购买品种的产地、供应商生产加工协调、沟通及指导。

教育经历

/8— 2013/6 北京协和医学院 生物化学与分子生物学 本科

证书

/12 大学英语四级

语言能力

英语(良好)听说(良好)，读写(良好)

自我评价

本人诚实正直，对工作认真负责，吃苦耐劳，善于创新，敢于迎接挑战及承担责任，富有工作热情，乐业敬业。善于与人沟通，营造和谐的工作氛围，注重人性化管理，能带动下属充分发挥团队合作精神，为公司创造效益。

九. 分子生物学实验员工作总结

慕课(MOOC)是大规模开放性在线课程(MassiveOpenOn-lineCourses)的简称，是“互联网+教育”理念下对教学方式的有效探索。在美国迅速崛起，众多知名大学相继推出在线开放课程，开始我国高等院校也加入其中。慕课使得世界范围内的优质教育资源实现了在线共享，适应了信息化时代的发展特点，只要有网络和移动设备(智能手机、平板电脑等)，随时随地都可以学习，开启了“指尖上的学习”新模式，为传统教学的改革创新提供了新的契机。在这种背景下，我们更加需要冷静地分析和大胆的尝试。先来分析一下高等数学课程在高职高专院校的现状。高职高专院校一直致力于培养高技能型人才，因此更加重视专业课和实践性课程，公共基础课程的地位相对比较薄弱。以高等数学课程为例，近几年来我院的高等数学课时被压缩至56学时，绝大部分专业甚至不开设高等数学课程。在这样的大环境下如何在有限的时间内将微积分的基本思想和方法传授给学生;培养学生将专业当中的实际问题转化为抽象数学模型的能力;培养学生了解和使用现代数学语言和符号的能力;为后续课程的学习以及终身学习提供必须、够用的知识储备和能力储备。这些问题一直困扰着一线的数学教育工作者，虽然大家一直致力于教学模式的创新和改革，但是收效甚微，而慕课的出现给这一问题的改善带来了新的希望。

(一)开发技术门槛低。全国高校微课教学比赛对微课的定义是这样的:微课是以视频为主要载体，记录教师围绕某个知识点或教学环节而开展的简短、完整的教学活动。微课的制作中也包含了使用摄像机直接拍摄、使用录屏软件直接录制PPT等简单易操作的方式，使得人人都具备开发微课的能力。

(二)短小精悍。微课的教学视频一般为5－8min，最长不宜超过10min。这是因为前十分钟人的注意力是最集中的，超过十分钟注意力就会逐渐下降。若根据内容需要视频时长超过了十分钟，则可以通过中途插入测试题的方式刺激学生提高注意力。微课的这一特点顺应了“微时代”的潮流，使得学生能够利用碎片化的时间、随时随地进行学习;一次只学一点，学生不会感到厌倦，提高了学习效果，增加了学习信心。

(三)在线开放性。微课借助于互联网进行传播的特性，使得学习的主动权更多更好地掌握在学生手中。学生可以根据自己的兴趣、时间安排、知识储备和学习需求自主选择课程、选择老师。传统课堂教学中，教师只能按照绝大部分学生的学习情况来安排教学进度，容易造成反应慢一些的学生消化不了，跟不上进度;反应快的学生吃不饱，浪费了时间。无论是哪一种情况，都会影响学习效果，降低学生的学习兴趣。而微课的在线开放性使得学生不必被动地在固定的时间被限制在固定的场所，他们可以自由选择学习时间和学习地点;微课还使得学生不必再被迫跟随教师的思维速度，学生在观看微视频的过程中可以根据自己的学习进度选择暂停、快进、回放等操作，对理解不透彻的地方可以反复观看，需要思考的地方可以选择暂停，已经掌握的内容可以选择跳过，这样一来学习过程就会变得更加有趣高效。

(四)实时互动性。除了微视频以外，微课还包含练习测试、在线提问与讨论等环节。学生在学习过程中遇到问题可以在线提问，老师或其他学习者都可以在线解答。传统课堂教学中，有些学生羞于提问，问题长期积累使学习效果大打折扣，学习信心和积极性受到打击。微课这种新型的学习方式使得这部分学生能够没有顾虑地勇敢提问、积极参与讨论和发表意见。这种克服了地域限制的大规模互动也有利于教师更好地了解学生的思维方式、思维误区和学习过程中遇到的困难，从而完善教学设计，制作出更高水准的微课。这种在线互动方式真正实现了师生之间的互相学习和共同进步，教师的角色从讲授者自然转换为激励者和启发者。

为了充分发挥微课的上述优势，使其能够更好地服务于高职院校高等数学教学，我对传统教学活动进行了如下尝试。

(一)精心制作微课资源。高职院校学生无论是在数学知识的积累、良好学习习惯的养成和学习能力等方面都存在不足，因此首先应该制作符合高职院校人才培养目标的，不同于本科的高等数学微课资源。教学设计中应坚持“以应用为目的，以必须够用为度”的原则，淡化理论推导和证明，不强调知识的系统性和逻辑的严密性。

(二)要求学生利用微课做好课前预习。教师提前两天布置学生观看相关微视频，完成在线测试。高职院校学生的学习主动性和自控能力较弱，为了督促学生实实在在地完成上述任务，我们准备了一份针对基本要求的当堂测试卷，以检验任务的完成情况和完成效果，并将测试成绩计入总评成绩。

(三)课堂教学主要完成下列任务。

1．根据学生在线提出的问题和相互讨论的情况，对微课涉及的知识点有侧重地进行补充讲解。例如:微课《复合函数》中虽然列举出了复合函数分解过程中“内外层函数区分不清”、“分解不彻底”的常见错误，但是在线测验的情况反馈出在进行具体复合函数分解时仍然有不少学生会出现这些错误，因此在课堂教学中就需要补充例题，展现更多不同类型函数的复合过程和分解过程，并逐渐增加复合层数，引导学生相互讨论、发现问题并加以纠正。事实证明这样能够很好地实现对基础知识的理解和对基本技能的掌握，为后续学习打下坚实基础。

2．对教学内容进行合理适度的延伸。以《初等函数》这部分内容为例，学生通过观看微视频和完成在线测试完全可以掌握本次课的基本概念和技能。在课堂教学中可以通过介绍取整函数和双曲函数来扩充延伸学生对初等函数的认知。按照认知规律尝试按照如下方式来介绍取整函数。首先让学生先从掌握定义开始，即:“不超过实数x的最大整数称为x的取整函数，记作［x］”，如［3．6］=3．但对于负数学生就容易出现错误，譬如把［－3．6］写成－3，这时就需要引导学生仔细分析定义，自主发现－3超过了－3．6，是不符合定义要求的，［x］指的并不是x小数点左边的部分，正确结果应该是－4．接着将概念延伸至对小数部分的理解。在取整函数中，规定x－［x］称为x的小数部分，记作{x}．例如，{－3．6}的小数部分不是－0．6，事实上{－3．6}=－3．6－(－4)=0．4．这样的规定与一般思维有所不同，计算这样的题目非常容易出错，借此能够扩展学生的思维。最后向函数图像、定义域、单调性延伸。让学生画出函数图像，再延伸讨论取整函数的性质:y=［x］的定义域是(－∞，+∞)，函数在定义域内单调递增且无界。在微课的讨论区已经发布了题目:认知双曲函数。课堂上对学生的回答进行整理归纳和补充。首先介绍双曲函数与悬链线的关系，解释为什么叫双曲函数;接着将双曲函数与三角函数进行对照，介绍其性质与恒等式;最后通过欧拉公式揭示两种函数之间的关系。希望通过对取整函数和双曲函数的学习，能够让学生从常见函数的惯性思维中脱离出来，认识到初等函数在实际中更加广泛的应用，提高学生应用数学知识解决实际问题的能力。

3．扩展学生视野。以《导数的概念》这部分内容为例，通过上述两个步骤，学生对导数的定义、几何意义的认知已经达到了一定的高度，接下来可以通过介绍魏尔斯特拉斯函数(Weierstrassfunction)来拓宽学生视野。在高等数学中，魏尔斯特拉斯函数是一种处处连续但又处处不可导的实值函数。因为处处不可导，所以画其图像时无法知道每一点该朝哪个方向画，因此它是一种无法用笔描绘出任何一部分图像的函数。将魏尔斯特拉斯函数在任一点放大，所得到的局部图形都和整体图形相似。因此，无论如何放大，函数图像都不会显得更加光滑，也不存在单调的区间。由魏尔斯特拉斯函数图形的这种自相似性(局部形态与整体形态相似)还可以进一步延伸至“分形(Fractal)”的概念，结合生动的图片介绍雪花图案、谢尔宾斯基三角形、皮亚诺曲线、罗马花椰菜等分形，让学生初步接触“分形几何”，并对其产生兴趣和继续学习的欲望。通过对魏尔斯特拉斯函数这个著名数学反例的介绍，改变学生对连续函数的直觉认识———连续函数的不可导点是有限的，加深学生对函数连续性、可导性的理解。

4．培养学生的应用能力。以机电专业为例，借助图解和解析法设计盘形凸轮轮廓涉及导数的概念、二阶导数和定积分;晶体管放大电路和带电源的简易函数发生器设计涉及导数概念、极值概念和定积分;圆轴扭转时横截面上的应力和强度条件的计算涉及微分的概念及其近似计算;剪力图与弯矩图涉及函数极值和曲线的凹凸性;梁的变形的计算、压杆的临界载荷涉及二阶常系数线性微分方程;连续量的力矩的计算涉及定积分的计算及微元法。通过实际问题的解决来提高学生运用数学知识和数学思想解决实际问题的能力。

(四)指导学生利用微课做好课后复习巩固工作。课堂教学结束后，若对某个知识点还存在疑问，学生可再次观看微视频;若有兴趣继续深入学习，教师可推荐学生参加其他相关微课的学习。这使得学习过程更加个性化、多元化。实践证明，这一流程很好地实现了微课对传统课堂教学的辅助作用。既发挥了微课资源的开放性和共享性、学习方式的灵活性和自主选择性、强大的互动性;又发挥了传统课堂进度有序可控、促进情感交流、培养团队合作精神和人际交往能力的功能。教师真正从知识的传授者转向了学习的指导者，从课程的实施者转向了课程的设计者;学生从被动学习转向了自主学习，合作学习。总之，尽管慕课这一新型教学模式仍然处于不断完善的发展阶段，但是毋庸置疑其对高职院校教学方式已经产生了颠覆性的影响。作为一线教育工作者，我们应该与时俱进，以服务和方便学生学习为目标，积极探索其在高职教育实践中的应用，推进高职院校高等数学课程的教学改革。

参考文献:

［1］刘万辉．微课开发与制作技术［M］．高等教育出版社，2015(1)．

［2］杨月梅，陈忠民，庞淑萍．慕课平台在高等数学教学中的应用［J］．教育探索，2015(8):140－142．

［3］袁逸，陈思文．慕课浪潮对高职教育的影响及应对策略［J］．常州信息职业技术学院学报，2016(6):8－10．

十. 分子生物学实验员工作总结

[摘要]该研究分析了虚拟现实技术，阐述了分子生物学的概念，针对虚拟现实技术在分子生物学实验教学中的问题进行深入研究，结合实践，最终提出了解决虚拟现实技术在分子生物学实验教学中的问题的对策。最终希望通过分析研究，实现虚拟现实技术在分子生物学实验教学中能够得到显著效果的目标。

[关键词]虚拟现实技术；分子；生物学；实验教学

虚拟现实技术的产生为生活带来了无数便捷，在虚拟现实技术中是以人为主体，人类从中获得从未有过的体验。该研究所说的虚拟的分子生物学实验是通过计算机软件开发以及网络的技术相结合形成的系统软件。它应用了Flash编写课件，汇集了图片、视频、音频、动画，创造了一个虚拟中的实验室。通过操作计算机就能够进行生物实验。具有多重特点。虚拟现实技术这种新型的仿真技术与分子生物学的教学实验相互结合，完善了老师教授实验教学模式，弥补了生物教学实验中产生的不足之处，把虚拟现实技术的特点发挥出最好的效果。为学生教学提供了更多的途径。目前，虚拟现实技术已应用在分子生物实验教学之中，提高了学生的学习兴趣，增强了学生独立思考的能力以及创造力，取得了不错的成果。针对这一技术，该研究作出了深刻具体的分析，现报道如下。

1虚拟现实技术

1.1虚拟现实技术的含义

所谓虚拟现实技术，是指人类利用计算机根据真实的环境设计并构造的模拟世界的一项技术。它是一种多种信息组合交集成为三维立体视图以及有真实能动性的仿真系统。它几乎和真实世界一模一样，人们仿佛置身其中。虚拟现实技术（VR）[行为能力、感觉、感应设备。所谓模拟环境，它是电脑设计出来的具有味觉、听觉等等。感应设备是指使三维立体视图交汇在一起的设备。

1.2虚拟现实技术的特点

作为新发展起来的仿真技术，虚拟现实技术有很多特点，如下所示。①与现实交集。虚拟现实技术可以说是一个仿真世界，它拥有着真实世界所拥有的一些事物，包括人类在内。仿真世界里的人物和我们一样有着感官以及能动性，唯一不同的是，它们需要我们用计算机来操作它们的行为[各种地震场景等等。这样有助于在现实生活中遇到这些情况时能够冷静处理，及时躲避，能够自救以及救助别人，确保我们人类的人身安全。③感觉置身其中。当我们操作电脑时，就会觉得仿真世界里面的人物就是自己，仿佛置身其中，体验不同的世界。仿真世界的真实程度会让你觉得和现实没有任何区别。④拥有感知能力。虚拟现实技术其中包含有感觉，这是说里面人物的感觉，他们有听觉，味觉，嗅觉，以及它们还有运动能力。⑤有针对的处理问题。在虚拟演练中，我们可以根据自身的弱点进行有针对性的练习，比如，当自己无法处理火灾事故时，我们可以利用虚拟现实技术进行演练，提高自己的应对能力。

2分子生物学

2.1分子生物学概念

分子生物学是指以分子为单位来探究生命活动规律的一门科学。分子生物学主要是研究蛋白质、蛋白质-核酸这一类分子的构造以及合成[进行实验、分析探究实验，最后得出结论。所以又说分子生物学的实践性很强。

2.2研究分子生物学的意义

所有生命现象的活动都是有规律的。就像生物都是由蛋白质还有核酸组成的。分子生物学的研究为人类带来了了解生命活动规律的机会，人们可以进一步改变生物构造作进一步的研究，为人类造福。

2.3相关应用

①克隆技术。分子生物学作为一门新兴边缘的学科，它的研究成果能够为人类造福。虽然目前我们仍处在克隆技术的最初级阶段，随着科学家不断探究以及实验，未来定会看到克隆技术所带给我们的福音。②DNA鉴定。随着分子生物技术的不断深入探索，科学家对基因的研究也有了很大的成果。DNA鉴定也为侦破案件提供了重要的证据。同时亲子鉴定也可以通过DNA检测获得帮助。③转基因。转基因（GMF）[4]是通过转换物种之间的基因而得到的另一个物种。转基因食品拥有了其它食品所没有的能力，例如，转基因食品防虫蛀，延长了保质期，而且是大批量生产，使生产成本减到最低，转基因食品不分季节，可以随时供应，满足人类的需要。但由于转基因食品的好坏尚不明确，还有待进一步研究实验。

3虚拟现实技术在实验教学中的特点

虚拟实验是虚拟现实技术与生物教学实验相结合的产物，是利用操作计算机让学生体验模拟的生物实验，实质上他就是计算机利用Flash技术开发的软件系统，为学生提供环境、设备，就像在真实的实验室一样。正是如此，虚拟实验有着真实实验室不可比拟的特点：①共同的系统。众所周知，计算机系统中的资源都是可以通过网络共享的。也就是说，人人都可以看到、用到。而虚拟实验证正是有这一特点，它可以通过计算机目录检索，学生所需要的相关数据、文件、电子图书，甚至是以前操作的实验都能找到。学生通过共享资源，节省了时间，提高了学习效率。②交流信息。资源可以在计算机上共享，同样的，在虚拟的实验环境中，学生可以尽情的交流，交换意见。③学生自由操作。虚拟实验是由计算机操作完成，学生通过操作计算机完成实验成果。所以学生拥有操作的权利，可以对虚拟仪器的使用进行操作。还可以随时上传相关数据，保存数据等等。④软件升级。随着社会发展迅速，信息步伐加快。虚拟实验也需要更新换代，软件需要升级。各种环境都需要被改变。我们也要跟上时代的脚步，随时准备虚拟实验进行扩充。⑤设备先进。虚拟现实技术是新兴的一种技术，所以在设备上都是采用最先进的。当然，虚拟实验的仪器也是最好的。

4虚拟现实技术在分子生物学实验教学中存在的问题

经过多次总结，虚拟现实技术在分子生物学实验教学中有以下几个问题。

4.1两者发展不健全

在分子生物学的实验教学中，分子生物学实验教学内容一直都很盲目注重实验的结果，对于实验的设计方面设想的偏少。教学中更注重实验，而忽略了学生的`综合能力的培养。学生没有设计过程，就不会了解整个实验的设计思路，及时得到了实验结论，也只是匆匆记住结果而已。老师的这种教学模式，严重阻碍了学生的能力发展。学生并没有从教学中学到任何技能。学生应该全面掌握实验教学过程，从设计实验、进行实验、分析探究实验，最后得出结论。这样才能与现代信息技术进行衔接。而虚拟现实技术也是目前新兴的仿真技术，还需要不断的完善。对于生物实验教学这一模块没有进行标准化，使用起来会很困难。在使用计算机操作虚拟现实技术上，老师和学生应提高使用计算机的能力。

4.2虚拟现实技术在分子生物学实验教学软件设计和上机操作问题

在设计软件时，设计者要和相关实验人员进行沟通，使设计出来的软件能够方便使用。让老师能够教会学生应用软件，同时能够让学生操作实验并得出相应的实验结论。老师与学生共同学习，不仅有生物实验，还有计算机软件操作的问题。

4.3现实与虚拟的空间问题

使用了虚拟现实技术，学生就进入到了另一个世界，在其中体验生物实验教学。两者的感受是截然不同的，学生不能沉浸在虚拟的世界中而忘记了教学的重点[5]。

5虚拟现实技术在分子生物学实验教学中应用的对策

5.1加强对计算机软件的学习

首先，学生要进行计算机培训，以保证学生都能够达到操作计算机的能力。其次，统一由软件人员进行虚拟现实技术开发的生物实验的软件的培训课程。教会学生操作软件，并能灵活掌握。以便学生能顺利操作实验，并得出正确结论。

5.2完善分子生物教学实验的教学

进行生物实验教学是学生教育中必行之路，而且教学目标中明确提出要求学生自主完成实验的设计与操作。有助于培养学生的综合能力，提高学生的专业知识水平。

5.3加强两者合作交流

软件设计者与生物实验人员要多沟通，使两者的结合得到更好地发展。同时也促进虚拟现实技术的应用在教育中有更好的发展前景。

5.4课前对学生进行教学指导

要让学生充分了解软件操作的目的是为了更好地、更加逼真地进行实验操作，分清现实与虚拟。学生在软件操作中学习知识，理解知识，充分了解实验的设计过程与操作过程及最后得出的结论。提高了分子生物学实验教学质量。

6结语

虚拟现实技术作为一种新兴的仿真技术，它为人类的生活带来了便捷，解决了人类对危险环境的及时应对问题。虚拟现实技术已经深入教学作为一种模式值得被重视。它解决了学校教育中教学过程的不完善，硬件设施的缺乏，教学环境等问题。从更开阔的视野以及多重的角度参透教育的特点，并对其开展一系列问题的分析研究。学生可以在过程当中进行深入探索和自主学习，为学生学习知识增加了乐趣，提高了学习的积极性。同时对计算机的操作，也提高了学生的综合能力，独立思考能力以及主观能动性。使学生更加积极向上，提高教学的质量和效果。不过，虚拟现实技术的发展尚处于起步阶段，还存在很多问题没有得到解决，还需要进一步研究[6]。

[参考文献]

[.

[2]徐辉，马秀峰.虚拟现实教育应用探析[J].山西师范大学学报:自然科学版,2013,24(6):95-97.

[3]张璇.虚拟现实技术在实验教学中应用的探讨[J].邢台职业技术学院学报,2014,26(3):6-8.

[4]BrentGWilson.MetaphorsforInstruction:WhyWeTalkAboutLearningEnvironmentsEducationalTechnology[J].2013.

[：126－128.

[6]刘梅.虚拟现实技术在教学中的应用探究[J].时代人物教学园地,2014(11):145.

十一. 分子生物学实验员工作总结

分子生物学它不象人体解剖学那样直观，不象生理学那样有条理化，更不象内外科那样有吸引力.很多医学大学生三羧酸循环学得很好，甚至很精，但对于后面的分子生物学，即基因信息传递一章却感到非常头痛，很多大五学生在考研时考虑到分值较小而干脆放弃对这一章的复习.其实大家只要强制自己静下心来花点时间先认真看好书本上分子生物学的第一章，即DNA的生物合成，当你对这一章看进去了，并且基本上看出了头绪，我相信你一定有信心有兴趣继续看下去，并且最好是连贯性地系统性地看后面的，争取一次性地看完分子生物学这一篇，用通俗的话说就是花大力气啃掉这块硬骨头.如果中途有特殊情况，那么间隔时间最好不要超过两天，否则你前面辛辛苦苦培养出来的兴趣将会消失的一干二净，你又将回到从前讨厌分子生物学的状态.分子生物学理论学习只有通过自己看书理解才能掌握。

除了学习分子生物学理论外，分子生物学实验也很重要，只有通过分子生物学实验才能学到书上学不到的东西。因此，最好在大学阶段进入老师实验室，跟老师研究生学习分子生物学技术，那样才能更好地学好分子生物学理论。

现在分子生物学实验发展非常快，如果只是看书根本掌握不到多少东西，如DNA、DNA提取、PCR、文库构建、测序等，在书上看着很复杂，而且印象还不深刻，如果进入实验室多做几次，其实这些实验是最基础的实验，而且不用看书都能自己做，原理非常复杂或高深难懂，但实际做起来也不是很难。

十二. 分子生物学实验员工作总结

关于生物化学与分子生物学硕士点的简介

生物化学与分子生物学学科由我国老一辈生化学家李昌甫、林钧才教授创建，《运动生物化学》课程，为硕士研究生开设《医学分子生物学》、《分子生物学实验技术》和《The Molecular Biology of the Cell》三门课程。学科高度重视开展科学研究，目前有心血管疾病分子生物学研究、医药生物技术应用与研究等肠道和肿瘤等重大疾病的分子生物学研究并取得了一定成果。

●重大疾病分子生物学：专业主要研究方向之一是心血管疾病研究，钱民章教授研究团队连续多年开展从整体、细胞及分子水平上对动脉粥样硬化的发生、发展和传统中药的治疗方面进行了比较系统的研究并取得了一系列的`成果，获贵州省科技进步三等奖一项和遵义市科技进步二等奖一项；专业主要方向之二是肠道菌群及肠粘膜免疫研究，欧刚卫教授在国外多年在本领域取得了较好的研究成果，回国后带领其研究团队从较高的起点开创了新的研究方向；

●医药生物技术应用与研究：应用转基因技术探索能提高中药品质又能保留中药特性的新方法，对贵州中药现代化产业有重要意义。开展用植物基因工程技术在马铃薯中生产肽类药物人白介素-12的研究。在国内首次应用反义核酸技术在细胞和动物实验中探讨白内障基因治疗的可能性，该研究获贵州省科技进步三等奖一项。

●干细胞增殖分化及其调控：创建了贵州省组织器官工程技术创新基地，在造血干细胞及羊膜细胞增殖分化及调控领域，取得重要研究成果，其整体学术水平居国内领先地位。

●药物分子生物学：探讨了药用真菌对细胞免疫活性调节和抗肿瘤作用机理，获诱发的动物毒血症及早期感染中动物体重要组织及巨噬细胞中炎性介质分泌和细胞因子基因表达变化并观察了药物的干预作用及分子机制，为中西医结合治疗炎症及毒血症提供了有价值的资料。对赤水金钗石斛进行了DNA分子标记的研究，对遵义中药产业化有重要意义。

●药物成瘾的神经生物学机制与治疗：研究药物成瘾的神经生物学机制和治疗，为吸毒人群的戒毒治疗和康复研究奠定理论基础。

●遗传多态与疾病：在基因水平研究人类遗传多态现象，探索基因多态与常见多基因遗传病发病风险的关系，紧跟人类功能基因组研究的主要内容之一即遗传多态与疾病关系的研究，在基因水平上积极探索人类疾病防治。

●药用动植物分子遗传学：立足于西南地区药用动植物资源，从分子遗传学水平对动植物的药用品质进行遗传资源评价和筛选，在药效化学成分分子机制探讨的基础上，利用遗传工程方法进行药用植物的种质改良等原创性研究工作。为地区药用资源的利用奠定理论基础.

●生物制药：主要立足于大鲵复方烧伤药的药学、药效学及临床前研究。

实验室目前建有细胞培养室、无菌工作室和核酸研究室、蛋白质研究室，拥有从事上述研究的多种先进设备，学科研究条件好。

硕士点现有教授9人，副教授13人，其中博士7人，硕士13人。

毕业1名；招收硕士生58名，毕业37名。

十三. 分子生物学实验员工作总结

分子生物学实验技术员 杭州杰毅麦特医疗器械有限公司 杭州杰毅麦特医疗器械有限公司,杰毅麦特,杰毅麦特 职责描述:

1.负责分子实验的试剂、样品制备,dna/rna的提取,pcr等实验室常规的分子实验工作;

2.负责体外诊断试剂产品的研究与开发;

3.负责实验方案的拟定、技术攻关、实验操作及数据分析整理;

4.负责实验室环境的清洁维护工作;

5.完成上级交代的其他工作。

任职要求:

1.生物学、医学相关专业本科以上学历,具备分子生物学实验技术或医学检验经验;

2.熟悉生物学或医学基础知识,对生物学或医学热点有充分认识和见解;

3.具备团队协作精神,工作认真负责,执行力强;

4.熟悉医学检验和诊断技术,有ivd产品研发经验者优先考虑。

十四. 分子生物学实验员工作总结

一、学位点简介

生物化学与分子生物学是在分子水平阐述生命现象、探讨生命本质的科学，是生命科学中进展最迅速、最具活力的前沿领域。

宁夏大学生物化学与分子生物学硕士学位点于“西部特色生物资源保护与利用”教育部重点实验室和“种苗生物工程”国家重点实验室，师资力量雄厚，仪器设备先进，拥有良好的学术氛围和优良的实验环境。学位点立足地区生物资源特点，在微生物与基因工程、人类遗传学、天然产物研究与开发和植物基因工程等研究院所、医疗单位、医药企业、生物技术企业等从事教学、科研、开发或管理工作。

二、专业方向

1．微生物与基因工程

重大动物疫病病原标本收集分析，确定并掌握相关疫病的传播、分布、消长和流行规律；病原微生物基因克隆、改造，分析研究基因结构及其表达调控理论；研究制备重组基因工程苗，建立快速有效的传染病诊断技术；基因工程药物相关基因的克隆、结构分析、原核与真核表达调控的研究；工业、农业、能源、环保微生物资源开发与利用。

2．人类遗传学

少数民族遗传资源的分布特点和遗传结构研究；建立少数民族人群遗传资源（包括重大疾病遗传资源）的收集和保存体系；开展少数民族人群遗传结构和重大疾病致病基因等遗传资源的研究。

3．天然产物研究与开发

利用现代生物化学技术手段从具有地方特色的天然资源中，对具有重要开发前景的生物活性分子如植物次生代谢产物、多糖、蛋白质、多肽等进行提取、分离和纯化，通过研究其生物活性，以期将其开发应用到医药，保健及化妆品等领域。

4．植物基因工程

立足地方特色植物基因资源，以现代分子生物学和植物抗逆及代谢生理为基础，发掘特色功能基因，通过基因操作和转化途径，研究植物抗逆及代谢生理机理，增强优势特色植物的抗逆性，改良其应用品质；建立地方特色植物生物反应器。

十五. 分子生物学实验员工作总结

《分子生物学》课程教学大纲（理论学时：16学时）

使用教材： 医学分子生物学

（供8年制及7年制临床医学等专业用）

分子生物学是一门从分子水平研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律的科学。医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支，是从分子水平研究人体在正常及疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。它主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。作为一门课程，医学分子生物学涵盖了医学各专业学生必须学习的分子生物学基础知识，以及分子生物学在医学领域中形成的专门研究领域及相关知识。

医学分子生物学既要较系统地了解分子生物学的基础理论知识和技术理论知识，同时也要了解分子生物学在医学领域的应用和相关研究进展。

本书共二十三章，包括5个方面内容。第二章至第十章介绍分子生物学基本知识，主要介绍基因和基因组的基本概念和基本特点，基因组核酸复制与损伤修复、基因表达和功能蛋白形成与降解、基因表达调控、细胞间通讯与信号转导的基本概念和基本理论，细胞增殖与凋亡的相关分子生物学机制。第十一章至第十三章介绍基因操作的基本知识，包括基因分析、基因功能研究和基因克隆与表达的相关基本知识和研究策略。第十四章至第十八章介绍疾病分子生物学机制，介绍了基因和基因组、细胞间通讯和信号与人类健康和疾病之间关系。第十九章至第二十一章介绍分子生物学理论与技术在医学中应用，包括基因诊断和基因治疗概念与相关研究。最后两章介绍分子生物学新兴研究领域、生物信息学在基因和蛋白质研究中的应用。

本大纲正是从上述目的出发，在要求学生掌握分子生物学基本知识与基本技术，同时了解分子生物学在医学领域的应用与相关研究。使学生们在分子水平上研究人体在正常及疾病状态下生命活动及其规律，为从事临床医学打下深厚的基础。

绪 论

一、目的要求

了解分子生物学的定义、研究对象和研究内容；分子生物学发展简史；生物遗传物质的发现；现代分子生物学的建立和深入发展；分子生物学与相关学科的关系；分子生物学在医学和生物学中的应用。

二、主要内容

分子生物学则是从分子水平研究生命现象及其规律的一门新兴学科。它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构与功能为研究对象

（一）、分子生物学的研究内容

分子生物学主要研究生物大分子的结构、功能、生物大分子之间的相互作用及其与疾病发生、发展的关系。

研究内容主要包括以下三个方面。1.核酸分子生物学 2.蛋白质分子生物学 3.细胞信号转导

（二）、分子生物学发展简史

1、生物遗传物质的发现

2、现代分子生物学的建立

3、现代分子生物学的深入发展

（三）、分子生物学与相关学科的关系

由于生命本质的高度一致性，分子生物学已经对生物学和医学的各个领域产生了全面而深刻的影响，并逐步形成了一系列的分子学科。可以使用同一套理论、同一套技术，来解释和研究不同的病理、生理现象，甚至治疗不同的疾病。

1、分子生物学与生物化学

2、细胞生物学与分子生物学

3、分子生物学与遗传学

4、分子生物学与生物技术

（四）、分子生物学与医学未来

分子生物学的发展和渗透从根本上改变了医学（包括临床和基础医学）各个学科的格局, 使医学各学科进入了一个更高的水平——分子水平。

1、分子生物学在医学和生物学中的应用

2、分子生物学与基础医学

3、分子生物学和病理学

4、分子生物学和疾病诊断

5、分子生物学和疾病治疗

基因治疗技术的发展与整个医学科学的发展以及许多分子生物学新理论、新技术、新方法的应用密切相关。

所谓基因治疗，就是用正常基因置换致病基因以纠正患者基因结构和功能异常的一种疾病治疗的方法。

狭义的基因治疗是指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部分，目的基因的表达产物起治疗疾病的作用。广义的基因治疗则包括通过基因转移技术，使目的基因得到表达，封闭、剪切致病基因的mRNA，或自杀基因产物催化药物前体转化为细胞毒性物质，杀死肿瘤细胞，从而达到治疗疾病的目的。

三、学时安排 1学时

第二章 基因与基因组

一、目的要求：

（一）掌握：基因的概念及结构特点；中心法则；基因转录调控相关序列；多顺反子，单顺反子；真核基因与原核基因的结构特点。基因组的概念；病毒、细菌及真核生物基因组的结构特征。

（二）熟悉：基因突变的意义，基因组变异的生理和病理学意义。

（三）了解：基因的命名法，基因组学；人类基因组计划。

二、主要内容

基因是负责编码RNA或一条多肽链的DNA片段，包括编码序列、编码序列外的侧翼序列及插入序列。编码RNA或蛋白质的DNA序列称为结构基因。原核生物的结构基因是连续的，其RNA合成后不需要经过剪接加工。而大多数真核生物基因在编码区内有非编码的插入序列。基因中含有与转录有关调控序列。真核生物基因中调控序列一般称为顺式作用元件。

大多数生物的遗传信息都是以特定的核苷酸排列顺序贮存在DNA分 子中。但在一些病毒中，RNA作为遗传物质。多数生物信息按照从DNA到RNA再到蛋白质的方向流。但是对RNA病毒是以RNA为模板，合成单链DNA，然后再合成双链DNA。

mRNA将DNA中信息传递给蛋白质。在mRNA编码区内每三个连续核苷酸，对应多肽链一个氨基酸，指导蛋白质合成。原核生物mRNA称多顺反子mRNA，而真核生物mRNA称单顺反子mRNA。

基因突变在进化上具有重要意义，它是形成生物多样性主要因素之一。同时基因突变可以改变遗传信息，导致疾病。导致基因突变因素有自发、物理、化学因素等，基因突变可直接影响蛋白质一级结构和空间结构，导致疾病或对疾病易感。

基因命名的基本原则是简明、独特、能够表达基因的特征或功能。基因符号的命名也应遵循独特、简短、仅含有大写拉丁字母或大写字母和阿拉伯数字、不应含有标点符号的基本原则。

1．重点内容：基因转录调控相关序列；多顺反子，单顺反子；基因组的概念；病毒、细菌及真核生物基因组的结构特征。

2．难点内容：基因的结构特点，真核生物基因组的结构特征。

三、学时安排

5学时

第三章 基因表达与基因表达调控

一、目的要求：

（一）掌握：遗传信息表达，转录，翻译，有意义链，转录模板链，开放阅读框，遗传密码等基本概念。基因表达，管家基因，组成性基因表达，诱导表达，阻遏表达，协调表达，表达调控，反式作用因子，表达组织特异性等基本概念；乳糖操纵子的结构及其调节机制。

（二）熟悉：原核生物RNA和蛋白质的生物合成基本过程，真核生物RNA和蛋白质合成特点；真核生物基因表达调控的各个水平，DNA水平调控的不同方式，反式作用因子的主要特点和调节方式，转录后调控的不同环节，翻译水平和翻译后水平调控的基本环节

（三）、了解：了解转录和翻译后的加工。反式作用因子结构域模式和反式作用因子的作用方式，基因表达的组织特异性和时相性。

二、主要内容

原核生物基因表达调控主要是在转录水平和翻译水平。转录水平的调控涉及启动子、S因子、阻遏蛋白、正调控蛋白等多种因素，翻译水平的调控则涉及SD序列、mRNA的稳定性及翻译产物的调控。

真核生物基因表达调控环节较多，在DNA水平可通过染色体丢失、基因扩增、基因重排、DNA甲基化以及染色质结构改变影响基因表达；在转录水平则主要通过反式作用因子的作用调控转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与转录因子-DNA复合物的结合以及转录起始复合物的形成；在转录后水平主要通过RNA修饰、剪接及mRNA运输的控制来影响基因表达；影响翻译水平的因素有影响翻译起始的阴遏蛋白、5`AUG、5` 端非编码区的长度等，另外还存在小分子反义RNA对翻译调控。翻译后蛋白质修饰和定位也是表达调控的重要环节。

同时近年提出的有关基因表达的统一理论惭被认识。从而形成一个完整的调控网络。

1、重点内容：

原核生物转录水平的调控机制；真核生物转录水平的调控机制；真核生物转录后水平的调控机制。

2、难点内容：

原核生物转录水平的调控机制。

三、学时安排

4学时

第四章 基因分析的基本策略

一、目的要求

（一）掌握：Southern 杂交和PCR等技术原理及在分析基因拷贝数的应用；Northern blot和RT-PCR技术原理及在基因转录水平变化分析中的应用；

（二）熟悉：Western blot 原理及在特定基因产物-蛋白质分析中的应用。

（三）了解：DNA序列测定的原理及其主要应用；RNA酶保护试验原理及应用；原位杂交技术；DNA微阵列技术原理； 流式细胞术的应用；免疫 组化方法的应用。

二、主要内容

基因分析是一种策略性很强的工作，有许多技术可以用于基因分析，正确选择实验技术方法和基因分析切入点是进行基因分析首先要考虑的问题。根据信息中心法则，DNA是遗传信息的携带者，RNA是基因的转录产物，蛋白质是结构基因的最终产物，因此，分析基因可从DNA、RNA、蛋白质水平上进行。同时研究者善于将各种技术有机结合起来，根据研究目的筛选适当技术方法，也可先制定研究策略，再进行实验技术路线设计。

1、重点内容：Southern 杂交和PCR等技术原理及应用；Northern blot和RT-PCR技术原理及应用Western blot 原理及应用。

2、难点内容：RNA酶保护试验原理及应用。

三、学时安排

3学时

第五章基因功能分析的基本策略

一、目的要求

（一）掌握：转基因模型研究基因的功能原理、基因敲除技术原理、利用基因沉默技术对基因功能进行分析的原理

（二）了解；三种实验技术的操作过程及注意事项

二、主要内容

基因功能分析可以在DNA、RNA和蛋白质水平上采用不同的技术和模 型来实现。模式生物是研究基因功能不可缺少的工具，转基因小鼠和基因敲除技术是目前研究特定基因功能最常用的动物模型，转染细胞是利用转基因技术建立的细胞模型。RNA干涉技术能够实现在RNA水平上暂时关闭特定基因的方法。各种方法都具有各自的特点及局限性，研究者可根据不同目的筛选最合适方法与模型，实现对特定基因功能的研究目的。

1、重点内容：转基因技术、基因敲除技术及RNA干涉技术原理

2、难点内容：转基因技术、基因敲除技术及RNA干涉技术各自优点及局限性

三、学时安排

3学时

第六章 基因工程与体外表达

一、目的要求：

（一）、掌握：常用克隆载体；基因克隆的基本过程；外源基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的原理和方法。

（二）、熟悉：限制性核酸内切酶和其他常用工具酶的概念和特点；定点诱变技术原理。

（三）、了解：昆虫表达系统；酵母表达系统。

二、主要内容：

基因工程指在体外对DNA分子按照既定的目的与方案进行剪切和重新连接，或将DNA中某个位点进行人工替换或删除，改造基因结构，然 后利用转化、转染、感染等方法将重组DNA导入宿主细胞，使DNA片段得到扩增。DNA的体外剪切和重新连接是在限制性核酸内切酶、边接酶以及其他修饰酶的参与下进行的。不同目的的克隆基因需要不同的载体，常用的载体有质粒、噬菌体和粘性质粒等。载体可与外源DNA在体外连接，构成重组DNA分子，导入相应的宿主细胞，能在宿主细胞中自行复制与表达。

克隆的基因可进一步用于表达有关基因的产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子以及基因的功能等。还可通过寡核苷酸介导法、含U模板法、PCR介导的定点诱变法等技术，定向改变克隆基因的序列结构，从而改造相应蛋白的结构。

基因工程在得到重组体后，通常利用大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫、酵母等表达系统进行克隆基因的体外表达。

1、重点内容：基因克隆的基本操作过程。

2、难点内容：α－互补筛选；阳性转染细胞的筛选；定点诱变技术原理。

三、学时安排：

6学时

第七章 基因诊断(自学)

一、目的要求：

（一）掌握：基因诊断的基本概念；掌握基因诊断中常用的分子生物学技术——核酸分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、单链构象多态性（SSCP）检测、限制性酶酶谱分析、DNA序列测定、DNA 芯片技术；

（二）熟悉基因诊断的基本方法；

（三）了解遗传病、感染性疾病以及肿瘤的基因诊断的策略；了解基因诊断在法医学中的应用。

二、主要内容：

基因诊断已成为临床实验医学的一个重要组成部分。PCR扩增和分子杂交是现代基因诊断技术的基本方法，基因诊断的基本操作流程是：样本抽提、样本扩增、分子杂交和信号检测。遗传病的基因诊断主要是针对DNA分子的遗传分析技术，其基本方法学包括连锁分析和直接诊断。用作连锁分析的遗传标志物主要有RFLP、STR、SNP。用于遗传分析的代表性直接诊断技术有：用于DNA制图的Southern印迹法、用于检测点突变的ASO分子杂交法以及用于识别STR序列的PCR直接扩增法等。同时基因诊断技术已经成为现代法医学的重要内容。

1、重点内容：各种检测方法原理

2、难点内容：各自优点及缺点

三、学时安排

3学时

第八章 基因治疗(自学)

一、目的要求：

（一）掌握：基因治疗、基因标记、基因置换、基因添加、基因干预、反义RNA、核酶等基本概念；

（二）熟悉：基因转移技术，逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体的特点；熟悉肿瘤基因治疗思路，理解抑癌基因治疗原理、实验研究和临床试验及肿瘤的免疫基因治疗；理解反义RNA在基因治疗中的意义和应用；

（三）了解：了解其它基因转移方法；了解核酶及三链DNA在基因治疗中的意义和基本原理；了解基因治疗的前景与问题。

二、主要内容

基因治疗是指以改变人类遗传物质为基础的生物医学学治疗，即通过一定方式将人正常或野生型基因或有治疗作用的DNA顺序导入人体靶细胞，以矫正或转换致病基因的治疗方法。目前开展基因治疗方案采取的策略包括：用正常基因置换染色体上致病基因，将正常基因转移至患者的宿主细胞，使治疗基因代替致病基因表达正常蛋白质而发挥作用；向患者体内或肿瘤细胞内导入肿瘤抑制基因，以抑制其表达；也可用反义RNA、SiRNA、核酶、肽核酸抑制或封闭有害基因mRNA表达；也可将抗体、细胞因子等基因导入肿瘤细胞以激活体内免疫细胞活力，增强患者免疫力。

治疗基因导入体内方法有非病毒方法与病毒方法，非病毒方法包括直接注射法、电穿孔法、脂质体转运法，其方法安全性好但效率低。与病毒方法各具有不同优缺点。

1、重点内容：基因治疗概念、基因治疗策略方法、2、难点内容：治疗基因导入体内方法，各自优缺点、病毒载体结构特点；核酶及三链DNA在基因治疗的原理

三、学时安排

3学时

第九章 基因组学与医学(自学)

一、目的求：

（一）掌握：基因组学、人类基因组计划、基因病和SNP的概念；结构基因组学、功能基因组学的概念及研究内容。

（二）熟悉：比较基因组学的概念；疾病相关基因的鉴定策略。

（三）了解：基因组学与医学的关系。

二、主要内容

人类基因组计划的研究目标是阐明构成人类基因组的全部DNA的结构；阐明基因的编码方式和分布特点；理解基因及其调控序列之间的相互关系；理解DNA全部序列所蕴藏的意义。该计划包括为遗传图谱、物理图谱、序列图谱、转录图谱分析。

功能基因组学是研究基因组中所有基因功能的学科。功能基因组学是从基因整体水平对基因的活动规律进行探讨，其研究内容主要包括基因组的表达、蛋白质产物的功能、基因组多样性的研究、基因组功能注释。

1、重点内容：人类基因组计划、功能基因组学的研究内容。

2、难点内容：功能基因组学的研究内容。

三、学时安排 2学时

四、实验内容及学时安排

1大肠杆菌质粒DNA的提取 3学时 2琼脂糖凝胶电泳检测DNA 3学时 3 DNA纯度、浓度和分子量的测定 4学时 4大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 4学时 5动植物基因组DNA的提取与纯化 4学时

十六. 分子生物学实验员工作总结

实验 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

一、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

二、实验试剂

1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。

2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。

3、溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。

4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

5、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）

6、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

8、溴化乙锭（EB）：10mg/ml

9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

10、6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。

三、实验操作

1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。

2、取1.0ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

3、将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

4、加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀,4℃离心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量离心管中。

6、加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心8000g × 10min。

7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.0倍体积（1ml）预冷的无水乙醇，混匀，室温放置５min，4℃离心12000g×10min，弃上清。

8、加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干或吹干（不能过于干燥，造成溶解困难）。

9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存备用。

四、质粒DNA的电泳检测

观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。

取制备的质粒DNA 1-2μl，加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。

五、注意事项

本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。

六、习题：

1、什么是质粒？质粒有什么主要用途？

2、分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而来的，它必须具备哪三个基本要素？

3、制备的质粒DNA在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？

实验 琼脂糖凝胶电泳实验

一、实验目的

（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；

二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：

（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。

（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。

（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。

（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。

常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。

三、试剂与器材

（一）材料

电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等

（二）试剂 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。

2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。

3、DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、DNA分子量标准

四、操作方法

常规的水平式琼脂糖电泳：

制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：

琼脂糖的含量（%）分离线状DNA分子的有效范围（Kb）

0.3 60-5

0.6 20-1

0.7 10-0.8

0.9 7-0.5

1.2 6-0.4

1.5 4-0.2

2.0 3-0.1

1、制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

2、胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；

3、加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。

4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板中央时，停止电泳。

5、观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。

五、注意事项

1、EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。

2、由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、实验报告要求与思考题

1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）

M：1Kb DNA ladder；1：质粒DNA

2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？

4、为什么分子生物学实施时要担心EB？

5、琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？

电泳流程图：

实验 PCR扩增eGFP基因

一、PCR技术的基本原理

PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR 技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。

1、模板：单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。虽然PCR 可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng 量级的克隆DNA，ug 级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。

2、引物：引物是决定PCR 结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。（1）尽可能选择碱基随机分布，GC 含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。（2）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3'—末端）的序列。

3、防止引物间的互补，特别要注意避免具有3'末端重叠的序列。

4、引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。

5、引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体解链；然后冷却至37—55℃，使引物与模板退

二、实验试剂

（一）仪器与器皿

PRC 扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性eppendorf管，凝胶成像仪

（二）试剂与材料

1、琼脂糖凝胶电泳试剂

1）电泳缓冲液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA

2）加样缓冲液：0.25%溴酚兰40% w/v蔗糖

3）溴化乙锭溶液：0.05mg/ml溴化乙锭/水

4）琼脂糖

2、TaqDNA 多聚酶3、5´反应缓冲液：

125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%

4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5 mmol/L)

5、DNA 模板

6、引物 1（10μmol/L）

7、引物 2（10μmol/L）

8、无菌水

三、实验步骤

1、按顺序在200μl 指形管中加入以下试剂与样品：（因购入的试剂批次不同，加样时有所差别，以预实验结果为准。

1）ddH2O 37μl

2）10*Buffer 5μl(含有MgCL2)

3）dNTP ２μl

4）引物1(上游)２μl

5）引物2（下游）２μl

6）模板 1μl（pEGFP质粒）

7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）总体积共50μl

2、在PCR 扩增仪上按以下反应条件编入程序：（以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR 扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA 片段的要求及仪器而定参数。）

1)预变性 94℃ 3 分种

2)循环条件（30 次）

变性 94℃ 30 秒

复性 55℃ 30 秒

延伸 72℃ 1分

3)延长延伸 72℃ 7 分钟

编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。

3、PCR 扩增完毕，配1.5%琼脂糖凝胶，电泳观察结果。

4、凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA片段

四、习题

1、PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？

2、为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？

3、用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？

实验 从动物组织（猪肝）中提取DNA

一、实验内容

采用SDS裂解和蛋白酶K消化法从猪肝中提取DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳分析。目的

(1)掌握SDS裂解法从猪肝中的原理和方法；(2)巩固DNA的琼脂糖凝胶电泳分析实验。

二、实验原理

DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。

三、实验材料

新鲜猪肝

TES 缓冲液 ： pH8.0 Tris-HCl 10 mmoL/L , EDTA 1mmoL/ L , SDS 0.1 mmoL/ L

四、实验步骤

1、剪取约0.5g肝脏组织，放入到研钵中磨碎；

2、向研钵中再加入1 ml TES轻轻研磨，将TES与破碎的组织混匀；

3、吸取535 µl组织匀浆液于2 ml EP管中，再加入60 µl SDS（10%），5.0 µl蛋白酶K，充分混匀后，于56°C保温1 h，每30分钟轻摇1次；

4、放置到室温，加入等体积饱和酚（600µl），颠倒混匀，11000 rpm，离心10 min，吸取400 µl水相，并转移至一个新的1.5 ml离心管中；

5、加入2倍体积（1000 µl）的无水乙醇和1/10倍体积（40 µl）3 M 醋酸钠沉淀DNA，12000 rpm离心10 min，弃乙醇；

6、加入适量TE溶解DNA和RNAse A（具体依DNA的多少而定），并利用0.7%的琼 脂溏进行电泳分析。

五、注意事项

1、在将猪肝剪碎前要将猪肝清洗干净，除去脂肪及系膜成分。

2、抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。

3、取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。

4、乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。

5、离心后，不要晃动离心管，拿管要稳。

6、在乙醇沉淀后，经离心要观察留在EP管中的小白点，其主要成分就是DNA，在以后的实验中都要细心观察，防止因将小白点丢失。

六、习题

1、为了获得高质量的肝脏DNA，在实验过程中应注意什么。

2、结合本人操作体会，总结在提取过程中如何避免大分子DNA的降解。

3、核酸提取中，去除蛋白质的方法有哪些？ 实验 限制性内切酶切割DNA

一、实验目的

1． 通过对DNA的酶切，学会设计构建体外重组DNA分子； 2． 根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶； 3． 掌握DNA的酶切技术。

二、实验原理

限制性内切酶是从细菌中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序，这一顺序大多为具有一对称中心的回文序列，如从大肠杆菌中分离的 EcoR I识别„GAATTC„ 切割后产生„CTTAAG„、„G 和

AATTC„的末端，„CTTAAG„该末端由于有一段小的能互补配对的单链突出，故称为粘性末端。切割后的末端为3’-OH和5’-磷酸基团，即„G-OH和„CTTAA-P。

有的限制性酶识别四碱基对的顺序，如 San3A识别„GATC „；有的识别六

碱基对，如上述的ECOR I。识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在DNA出现的频率更高（四碱基酶为44=256，六碱基酶为46＝4096），因而可将DNA切割成更小的片段，而识别八碱基对的Not I„GCGGCCGC„、„CGCCGGCG„ 则识别和切割位点更少（48＝65536），但碱基并不以均等的概率出现，因而切割后产生的片段变化范围很大。

＋

限制性内切酶作用的温度一般为37℃，反应体系中以Mg2为唯一的辅助因子，且要求pH缓冲在7.5左右。

商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃贮存，活性通常较高，5u/μl（每单位即最适条件下1小时内完全酶解1μg DNA的酶量）。

三、实验材料

待酶切的DNA样品

四、实验仪器、器皿及试剂

1、仪器：可调微量加样器、恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、紫外检测灯

2、器皿：Eppendorf管、Tip、试管架

3、试剂：标准DNA(Marker)

EcoRI限制性内切酶

10×buffer：50mmol/l NaCl

10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)

10mmol/l MgCl2

lmmol/l

DTT（二硫苏糖醇）

五、实验步骤

1、将DNA样品8.5μl(质粒pEGFP, 1μg)

2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由厂家提供。

3、加入1u（0.5μl）的限制性内切酶EcoRI（限制性酶很昂贵，从-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip头，以免污染杂质，吸完后尽快放回冰箱）。

4、混匀反应液后，稍离心使液体聚集，置37℃温育１小时。

5、进行电泳检查酶切结果，100V 25分钟。

6、紫外灯下观察消化效果。

六、注意事项

1、分子生物学实验大多为微量操作，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性以保证酶切效果最佳。现介绍三种微量取样方法：

(1)吸样时，将Tip尖刚刚接触到液面时，轻轻吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的样品，注意不要将Tip尖全部插入溶液，这样Tip壁上会沾上很多的样品，导致吸样不准。

(2)用1cm长的塑料毛细管代替Tip吸样，此法也可吸取0.2~0.5μl的样量。

(3)目前也有细长Tip出售，专门用于吸取微量样品。

2、限制性内切酶价格比较贵，因此要注意不使其污染而导致浪费。这就要求每次吸酶时要用新的无菌Tip。另一个造成限制性内切酶浪费的因素就是限制性内切酶的失活。因此，要注意加样次序，即各项试剂加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要尽可能快，以使限制性内切酶拿出冰箱的时间尽可能短。

若用同一酶消化很多样品时，可先计算出所需酶量（可稍多计一点），取出此量的酶与1×缓冲液混合，然后再分装至各个反应管内。这样可节约用酶且缩短操作过程、减少污染机会。

3、开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防杂酶污染。

4、样品在37℃与65℃保温时，要注意将Eppendorf管盖严，以防水进入管内造成实验失败。

5、无实验必要应尽量避免长时间酶消化样品。因长时间消化，限制酶溶液中可能存在的杂酶会影响试验结果。

七、习题

1、限制性核酸内切酶天然存在于什么生物体内？

2、什么是细菌的限制-修饰系统？限制-修饰系统对细菌有什么用途？

3、限制性内切酶有几类？这几类限制性内切酶各有什么特点？可作为工具酶的限制性内切酶是哪一类？为什么？

4、限制性内切酶的识别序列有什么特点？称为什么序列？

5、酶通常在什么温度中保存？为什么酶在该温度下保存不会结冻？酶最后工作的时候其甘油浓度必须低于多少？ 6、1个单位（1 U）的限制性内切酶代表什么意思？

实验 质粒的转化

一、实验目的

掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。实验材料：质粒DNA；大肠杆菌感受态细胞。

二、实验原理

质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。

（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。

（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。

三、实验步骤

1、制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中（冷却止55摄氏度以下）加入Amp至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中；

2、取出1管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；

3、每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟；

4、热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；

5、冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；

6、复苏：每管加400 μl LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；

7、布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；

8、培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色的菌落，即为转化子。

四、结果与分析

计算转化效率

菌落数/DNA质量（μg）*稀释倍数

五、习题

1、制备感受态细胞的关键是什么？

2、如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。

3、如何提高转化效率？

十七. 分子生物学实验员工作总结

超英生物实验室分子生物学系列服务项目

1、DNA提取（组织、细胞、血液、蜡块）,质粒提取，基因克隆、纯化。

2、蛋白提取、定量。原核及真核基因蛋白表达纯化（盐析与透析）、分析鉴定、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,western-blot(常规DAB显色及化学发光)

蛋白组学相关技术

免疫蛋白质印迹(Western blotting)是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

3、总RNA提取 定量、电泳。总RNA是一种非常重要的试验材料。本公司可以提供从多种材料中提取总RNA的服务。常见的有：血液、培养细胞、动物组织、植物

4、聚合酶链反应（PCR）

5、RT-PCR：组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA.再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达.降落PCR 引物设计及PCR相关实验

6、细胞培养、细胞冻存、原代细胞的分离与培养、细胞转染及细胞生物学相关技术

7、细胞凋亡检测(TUNEL,单细胞凝胶电泳等)

8、细胞周期调控,同步化细胞

9、特殊的细胞爬片材料,提供检测爬片细胞的特异性抗体检测,客户所感兴趣的基因检测

(RISH,DISH,IS-PCR,PRINS)

十八. 分子生物学实验员工作总结

分子生物学它不象人体解剖学那样直观，不象生理学那样有条理化，更不象内外科那样有吸引力.很多医学大学生三羧酸循环学得很好，甚至很精，但对于后面的分子生物学，即基因信息传递一章却感到非常头痛，很多大五学生在考研时考虑到分值较小而干脆放弃对这一章的复习.其实大家只要强制自己静下心来花点时间先认真看好书本上分子生物学的第一章，即DNA的生物合成，当你对这一章看进去了，并且基本上看出了头绪，我相信你一定有信心有兴趣继续看下去，并且最好是连贯性地系统性地看后面的，争取一次性地看完分子生物学这一篇，用通俗的话说就是花大力气啃掉这块硬骨头.如果中途有特殊情况，那么间隔时间最好不要超过两天，否则你前面辛辛苦苦培养出来的兴趣将会消失的一干二净，你又将回到从前讨厌分子生物学的状态.分子生物学理论学习只有通过自己看书理解才能掌握。

除了学习分子生物学理论外，分子生物学实验也很重要，只有通过分子生物学实验才能学到书上学不到的东西。因此，最好在大学阶段进入老师实验室，跟老师研究生学习分子生物学技术，那样才能更好地学好分子生物学理论。

现在分子生物学实验发展非常快，如果只是看书根本掌握不到多少东西，如DNA、DNA提取、PCR、文库构建、测序等，在书上看着很复杂，而且印象还不深刻，如果进入实验室多做几次，其实这些实验是最基础的实验，而且不用看书都能自己做，原理非常复杂或高深难懂，但实际做起来也不是很难。

生命科学发展日新月异，特别是微观生物学的发展速度可谓惊人。作为一名本科生，最重要的就是掌握好基础知识，为今后的科研工作或是研发工作打下基础，这样才能跟得上知识和信息发展的脚步。分子生物学作为微观生物学的根基，学好它无疑将为将来的发展打下最坚实的基础。

最近我读了一篇文献，是有关不同类型的弥散性大B细胞淋巴瘤的基因表达分析的。弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL),最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型,是在临床上异构的:40% 的患者目前的治疗反应良好,长期生存,而其余屈服于疾病。我们认为这种可变性在自然历史反映了识别分子在肿瘤异质性。两个不同的分子形式的DLBCL有着不同的gene表达模式，表明了B细胞有不同的分化阶段。一种是表达中心B细胞的基因表达特征(中心B细胞类似DLBCL)，另一种是表达体外激活诱导外周血B细胞(激活B细胞类似DLBCL)。其中中心B细胞的存活率大于激活B细胞。我们发现肿瘤的分子分类的基础上的基因表达可以识别以前未被发现和临床癌症的重要亚型。构建了一个特异性的DNA微阵列，分析淋巴恶性肿瘤的基因表达，判断基因表达模型和肿瘤表型，最后利用分层系统树图得出结论。

从文献中我了解了DNA微阵列技术，掌握了DNA微阵列技术的方法，学会了分析分层系统树图，更认识到了弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL)研究的重要性。分子生物学是一门前沿的学科，我们只有努力学习英语，经常阅读中外文献，亲自参与到实验中去，才能了解分子生物学最新的研究成果，掌握分子生物学中的研究分析方法。

通过一个学期的分子生物的学习，第一，我掌握了以中心法则为核心的最基本的分子生物学知识

锻炼了专业英语阅读和写作能力，也 接触了微观生物学前沿，培养了一定的科研思维能力。学习分子生物学提高了我们的微观生物学素养，为今后的进一步学习打下了坚实基础，同时了解了最新的微观生物学进展，让我们对生物学科研有了一定的感性认识。

学习生化。我学生化的时候，平时也没怎么看书，基本是考前突击的!因为我知道，像这么抽象的课程，按照我这个记忆水平即使平时看了书，到时候不下工夫复习，一样是什么都不记得的!所以，我利用考前的2个星期突击了一把，感觉效果还可以!我看第一遍书的时候，是把书都通看了一下(不过没有讲的我没有看)，掌握了基本的内容，在看书的过程中，写出一些简要的提纲，我还把一些重要的知识点一边念，一边抄，然后再背着默写一遍，晚上睡觉前反复回忆，结果做梦都是这些东西，呵呵!第二、三遍主要就是根据这些提纲来回忆、复习，忘记的就再看书，不要怕重复，只有这样才记的牢靠!最后一遍书主要是大概看一下课本，把专业英文单词看了一下(因为我们要考20分的英文题目，还要英文回答!)，整理一下思路!

下面就是根据我复习的经验总结的一些重点：三大物质的代谢以及相互转化，这可是重中之重，一定要掌握(尤其是三羧酸循环)!再有就是呼吸链、以及胆色素的代谢!其他的就是掌握一些蛋白质、DNA和酶的一些基本知识!分子生物学的内容主要是DNA、RNA和蛋白质的合成的过程一定要掌握，考试的主要分数都是出在这里!

顺便说一下，我复习生化的时候用的是北医编的一本参考书，是16K，蓝色封面的那本，虽然有的题目比较有难度，但是对于理解一些知识点还是很有帮助的!那本书的名词解释和问答题比较全面，也很细，考试可以参照那本书准备相应的题型!

十九. 分子生物学实验员工作总结

   摘要：钾离子通道是植物钾离子吸收的重要途径之一。近年来，已从多种植物或同种植物的不同组织器官中分离到多种钾离子通道基因，包括内向整流型钾离子通道基因(如OsAKT1，DKT1，Ktrrl，KIll，KZM1，ZMK2等)和外向整流型钾离子通道基因(如CORK，PTORK ，STORK 等)。文章分别从结构、功能以及相关基因等三方面综述了关于植物钾离子通道的分子生物学研究进展，并对应用生物工程技术改良植物的钾营养性状进行了讨论。

   关键词：钾离子通道；结构；基因

离子通道(ion channe1)是跨膜蛋白，每个蛋白分子能以高达l08个／秒的速度进行离子的被动跨膜运输，离子在跨膜电化学势梯度的作用下进行的运输，不需要加入任何的自由能。一般来讲，离子通道具有两个显著特征：
   一是离子通道是门控的，即离子通道的活性由通道开或关两种构象所调节，并通过开关应答相应的信号。根据门控机制，离子通道可分为电压门控、配体门控、压力激活离子通道。
   二是通道对离子的选择性，离子通道对被转运离子的大小与电荷都有高度的选择性。根据通道可通过的不同离子，可将离子通道分为钾离子(potassium ion，K )通道、钠离子(natrium ion，Na )通道、钙离子(calcium ion，Ca2 )通道等。其中，K 通道是种类最多、家族最为多样化的离子通道，根据其对电势依赖性及离子流方向的不同，可把K 通道分为两类：①内向整流型K 通道(inward rectifier K channel；Kin)，② 外向整流型K 通道(outward rectifier Khannel；K out)。K 是植物细胞中含量最为丰富的阳离子，也是植物生长发育所必需的唯一的一价阳离子，它在植物生长发育过程中起着重要的作用，具有重要的生理功能。植物中可能存在K 通道，这一点早在20世纪6o年代植物营养学界就有人提出，而一直到80年代才被Schroeder等人[23证实，他们利用膜片钳(patch chmp)技术，首先在蚕豆(V／c／afaba)的保卫细胞中检测出了K 通道钾离子通道的结构单个钾离子通道是同源四聚体，4个亚基(subunit)对称的围成一个传导离子的中央孔道(pore)，恰好让单个K 通过。对于不同的家族，4"亚基有不同数目的跨膜链(membrane。span。ning element)组成。两个跨膜链与它们之间的P回环(pore helix loop)是K 通道结构的标志2TM／P)，不同家族的K 通道都有这样一个结目前从植物体中发现的K 通道几乎全是电压门控型的，如保卫细胞中的K 外向整流通道等，其结构模型如图2一a所示。离子通透过程中离子的选择性主要发生在狭窄的选择性过滤器(selectivity filter)中(图2一b)，X射线晶体学显示选择性过滤器长1．2 nIll，孔径约nIll，K钾离子通道的作用.有关K 通道在植物体内的`作用研究并不多。
   从目前的结果来看，认为主要是与K 吸收和细胞中的信号传递(尤其是保卫细胞)有关。小麦根细胞中过极化激活的选择性内流K 通道的表观平衡常数Km值为8．8 mmol／L，与通常的低亲和吸收系统Km值相似[ 。近年来，大量K 通道基因的研究表明，K 通道是植物吸收转运钾离子的重要途径之一。保卫细胞中气孔的开闭与其液泡中的K 浓度有密切关系。质膜去极化激活的K 外向整流通道引起K 外流，胞质膨压降低，导致气孔的关闭。相反，质膜上H．ATPase激活的超极化(hyperpolarization)促使内向整流钾离子通道(K in)的打开，引起K 的内流，最终导致气孔的张开钾离子通道相关基因及其功能特征迄今，已从多种植物或同种植物的不同组织器官中分离得到多种K 通道基因(图3)，根据对其结构功能和DNA序列的分析，可以把它们分为5个大组：工，Ⅱ，Ⅳ组基因属于内向整流型通道；m组属于弱内向整流型通道(weakly inwardAKT1Arabidopsis K Transporter 1)是第一个克隆到的植物K 通道基因，采用酵母双突变体互补法从拟南芥cDNA文库中筛选出来cDNA序列分析表明，AKT1长2 649 bp，其中的阅读框为2 517 bp，编码838个氨基酸残基组成的多肽，相对分子质量约为95 400 Da。AKT1编码的K 通道，对K 有极高的选择性，其选择性依次是K >Rb >>Na >Li 。

二十. 分子生物学实验员工作总结

【摘要】在初中阶段，英语阅读课占主导地位，英语阅读能力尤为重要，而阅读理由的设计又直接影响阅读效果。

笔者针对阅读课中理由设计的重要性、设计的原则以及理由的分类，阐述如何在阅读课上科学的设计理由：包括理由明确具体、有计划性、有启发性、有多样性、有阶梯性、有度。

以此来体现阅读课教学的实效性，从而提高初中生的英语阅读能力。

在初中英语教学中，阅读课已占据主导地位，它直接关系到学生的阅读能力和效果。

目前，在我国，初中阶段的英语教学过程中，存在以下理由：教师没能在课堂上给学生提供充足的深思理由的时间;教师直接公布答案多，

分析理由过程少;优秀生回答理由相对过多，中等及中等以下学生回答理由相对过少;理由的设置没能引导学生积极参与课堂活动、引发学生积极深思的阅读习惯等等。

基于上述理由，在本篇论文中，笔者主要针对初中英语阅读课上，如何科学合理地设计理由进行研究。

之前，也有很多学者进行了系统性的研究，提出了一些策略和策略。

本课题结合了前人的经验，又提出了一些个人的观点，以改善初中英语阅读课教学。

英语阅读课的目的是教会学生阅读策略和阅读技巧，有目的的阅读材料，获取其中的相关信息，并对所获取的信息进行分析，归纳，进行信息重组，以此来理解文章的内容。

因而，在阅读教学中，理由的设计极为关键。

好的理由可以让学生大大受益。

科学、合理及巧妙的设计理由会更大限度的理解文章的内涵，提升学生的学习兴趣，引发学生积极主动的深思，进而提高课堂阅读的效率，从而达到优化课堂的效果。

教师在课堂教学中，应重视理由的设计，把学生引入理由情境，引导他们积极深思，提高学生的语言综合运用的能力。

由此可见，学生学习英语的过程中，阅读能力尤为重要，而理由的设计又直接影响阅读的效果。

因此，笔者通过对初中英语阅读课的理由设计进行研究，希望提高学生的阅读能力。

教师设计课堂上所提的理由，必须围绕教学目标，为完成本堂课的教学任务服务。

备课时要认真钻研教材，紧紧围绕重点、针对难点、扣住疑点，避开随意性、盲目性和主观性。

教师设计理由时应分出层次，力争让不同层次的学生在不同程度上有所发展，从而实现因材施教的原则。

知识的掌握、学生能力的培养是一个由少到多、由浅入深、由易到难逐步积累的过程。

提问的设计要遵循由浅入深，由易到难，循序渐进。

教师在理由的设计过程中，充分了解学生的实际情况，正确认识学生并科学地估计他们的知识和智力水平，真正做到从学生实际出发，理由设计要有“弹性”。

至于初中英语阅读课教学理由的分类，从阅读材料本身来看，“理由大致分为以下三类：认知类理由，分析类理由及评价类理由。

认知类理由相对来说比较容易，理由的一般针对句子的表层意思，学生只需读懂字面意思，就能准确的回答理由，不必考虑句子之间的衔接关系以及段落之间的内在联系，

这类理由只要通过快速阅读或浏览就能把握文中事实和细节，从阅读材料中找出正确答案。

这类练习可训练学生又快又准的获取信息的能力。

与认知类理由相比，分析类理由难度上升，不仅要求学生掌握句子的表层意思，更能挖掘句子的深层含义，并考察学生理解、分析理由的能力。

回答分析理由时，既要理解句子的字面意思，而且能理解句子的隐含之意，并运用文中的语言线索进行分析、重组和归纳，根据上下文揣摩真正的含义，这种练习可以训练学生分析、推理和归纳的能力，是阅读能力提升的重要手段。

关于评价类理由，要求学生根据阅读材料中的相关内容，结合自身的认识和看法，围绕阅读材料中的理由表达自己的观点。

这类理由不仅是对学生思维能力的考察，也是对学生语言能力的检验，难度大，层次高。

基于以上三种分类，教师在设计理由的时候一定要多加深思，巧妙、科学的进行设计。

而从学情来看，教师应根据学生的情况来设计理由。

在一个班级中，学生的层次大不相同，因此，在设计理由的时候应照顾到每一位学生，让所有的学生都参与到课堂活动中，才能体现课堂教学的实效性。

阅读理由的设计要符合学生的水平，能为学生理解，让学生有思路可循，切不可含糊不清，影响学生的阅读效果。

教师在设计理由前，要仔细备课，认真研读阅读材料，之后精心设计理由。

而且，对于同样一个理由，可能会有几个答案，这就要求教师深思如何进行正确的引导，如何训练学生的多角度的深思理由的能力。

教师在设计理由时，要考虑理由的提出会训练学生的思维能力，让学生在深思后得出答案，从而，让学生在课堂上养成动脑的好习惯，积极参与深思理由的教学活动中，进而，提高英语的阅读能力。

为了更好的理解一篇文章，阅读理由的设置要灵活多样，在教学过程中，可设置选择题，问答题，判断正误题，填充表格题等等，全方位、多角度的训练学生的阅读能力。

首先，阅读理由的设计应难易结合，因为我们学生的层次参差不齐，这样题型的设置会让全体同学都参与到课堂活动中来，而不是只关注某几个学生。

这样的教学手段会推动所有同学学习的动力，积极投入课堂活动，认真完成学习任务。

其次，阅读理由的设计应层层递进，先设计一些铺垫性的理由，逐渐深入，提出揭示文章主题的理由，由浅入深，一环扣一环，达到理解文章深层含义的目的。

理由的设计要把握好度，难度、深度和广度。

科学的设计理由，可以激发学生的求知欲，调动学生的注意力，让学生体会到学习和深思的快乐，同食也激发学生的思维能力，提升英语的综合能力。

初中英语阅读教学中，理由设计尤为关键。

在理由设计与实施的环节，应根据学情，设计好每一个理由。

理由的设计要明确具体，有计划性，有启发性，有多样性，有阶梯性，有度。

要符合学生的水平，要精心设计、深思理由，要注重学生思维能力的培养，理由的形式要灵活多样，理由要难易结合、鼓励全员参与，要把握好难度、深度和广度。

理由之间应有联系，层层递进，环环相扣。

遵循着这样的设计模式，应用于教学实践，实现对阅读课教学的改善。

参考文献：

〔2〕范煜华 精心设计课堂提问，提高课堂教学效率 中小学外语教学 .6

〔3〕高艳琳 中学英语课堂教师话语的调查与研究〔A〕中小学英语教学与研究 〔J〕2002-09

〔5〕徐育兵 课堂提问初探〔A〕中小学英语教学与研究 〔J〕-05

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